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鸭疫里默氏杆菌病又称为鸭传染性浆膜炎,是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的一种急性或慢性败血性传染病,发病率可高达70%,是造成当前养鸭业经济损失的主要传染病之一。密度感应(Quorum Sensing,QS)是细菌通过分泌自诱导信号分子(Autoinducer,AI)来监测细菌群体密度,并协调细菌生物功能的交流机制,目前已成为微生物学的研究热点。细菌中5’-甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(5’-Methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase,Pfs)在细菌代谢方面具有重要作用,参与QS系统信号分子AI-2的合成,AI-2对细菌的生理功能具有重要的调控作用。目前关于RA Pfs的功能尚未见相关报道,因此,我们开展如下研究:1.RA pfs基因缺失株和回复株的构建及其生物学特性研究分别扩增pfs基因的上下游序列(约1kb),克隆至载体p DS132中,构建pfs缺失质粒,利用接合转导的方法成功构建了RA pfs缺失株Th4Δpfs。将包含pfs基因及其启动子的ORF,克隆至大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌穿梭载体p CP29中,构建了回复质粒p CP29-pfs,转化至RA中,成功构建Th4Δpfs的pfs基因回复株c Th4Δpfs。生物学特性研究表明,与野生株Th4相比,缺失株Th4Δpfs生长速度较慢、对14日龄雏鸭的致病性(LD50)无显著变化、对Vero细胞的黏附入侵能力显著增强(P<0.05)。回复株c Th4Δpfs的生物学特性能基本回复至野生株Th4的水平。2.RA pfs参与AI-2合成的功能验证Pfs和Lux S催化底物SAH可产生细菌的信号分子AI-2。RA由于缺乏lux S基因,不能合成AI-2。为验证RA pfs是否参与合成AI-2,分别构建了3种含禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)lux S基因的回复质粒p CP29-RApro-lux S、p CP29-APECpro-lux S和p RES-RApro-lux S,并转化至RA Th4野生株中。结果3株APEC lux S过表达RA菌株的AI-2检测结果均为阴性,表明RA pfs与APEC lux S不能在菌体内催化底物SAH产生AI-2。推测RA可能存在SAH水解酶基因Sah H,从而竞争性地抑制了APEC lux S过表达RA菌株中Pfs和Lux S与底物SAH的反应,即合成AI-2的能力。菌体外试验表明RA Pfs与APEC Lux S可催化SAH产生AI-2分子。3.RA Pfs单克隆抗体的制备成功制备了RA Pfs单克隆抗体1株并命名为2E2E6,小鼠腹水抗体效价高达1:64000;抗体分型检测结果表明,该单抗为Ig G1亚类,轻链为κ链。Western Blot检测结果表明,该单抗仅与血清2型Th4株发生特异性反应,与血清1型和10型RA菌株、大肠杆菌、沙门氏菌和禽巴氏杆菌等均无特异性反应。该单抗的成功研制为Pfs活性表位的研究奠定了基础。本研究构建了RA pfs缺失株和互补株、并对其生物学特性进行了测定;验证了RA Pfs具有在体外参与合成AI-2的活性;成功制备了一株Pfs单克隆抗体。结果为RA密度感应系统的研究提供参考。