我国正处于工业化、城镇化进程加快的时期，能源消费强度较高，能源形势非常紧张。因此，对于新型能源的开发，既是解决当今能源危机的必经途径，也是子孙后代赖以生存发展的基础。地球上的能量主要源自太阳能，而被固定的能量主要以生物质的形式储存。人们把解决能源困境的希望寄托在具可再生性的生物质资源上，是很自然的，这既源于生物质资源惊人的总量，也因为其相对清洁、廉价。然而，生物质资源高值化、有效化的利用仍然存在种种瓶颈。 生物质资源的有效利用涉及多个方面，从基础科学的研究到产业化的工艺流程，最终的成功可能会受益于每一个微小进步的积累。山大微生物技术国家重点实验室作为多年来一直研究生物质资源利用的实验室，开发新型纤维素酶以及研究天然条件下纤维素的降解是我们关注的重点问题之一。然而由于微生物可培养性的限制，现在对于纤维素天然降解的理解仅仅来自少数模式微生物，研究材料也主要限于修饰过的底物，特别是对于自然生境这样一个复杂体系还缺乏相应的研究手段。 因此，本论文针对上述问题，以天然腐烂的秸秆青贮作为研究对象，分析鉴定了其中主要降解真菌，并分离了此真菌中有工业应用价值的内切纤维素酶，通过同源模建找到了与其耐酸性质相关的可能氨基酸位点；用直接纯化的方法分析了秸秆青贮中的纤维素酶，通过比较发现传统分离方法具有局限性；最后建立了不依赖于培养的直接从天然生境中分离纤维素酶的研究策略，取得了一定创新性结果。 1 发现秸秆青贮降解中主要真菌为烟曲霉通常由纤维素降解材料中分得的真菌为木霉、曲霉类。在天然腐烂的秸秆青贮中，一株真菌Y05生长迅速，产孢子能力强，生长温度较高，用传统纤维素平板法筛选时，能掩盖其它微生物生长，经18S rDNA鉴定和形态鉴定，Y05为烟曲霉属，其具体分类为：Cellular organisms；Eukaryota，Fungi/Melazoa group； Fungi：子囊菌门Ascomycota；盘菌亚门Pezizomycotina；Eurotiomycetes；散囊菌目Eurotiales；发菌科Trichocomaceae；丝孢发菌科mitosporic Trichocomaceae；曲霉Aspergillus；烟曲霉Aspergillus funmiatus。 1．1烟曲霉产生的纤维素酶具有耐酸性，从烟曲霉胞外酶液中分离得到分子量为25KD的耐酸内切酶纯组分众所周知，酸性纤维素酶组分更适于工业化条件下糖化酶解工艺的需要，然而通常木霉、曲霉的纤维素酶最适pH在4.8-5.5左右。 玉米秸粉对Y05纤维素酶合成有很强的诱导能力。初期由于缺少易于利用的糖，生长和产酶比以麸皮为底物时延后，但是由于玉米秸粉结构更加复杂，纤维素含量更高，因此表现出比麸皮更高的诱导能力。而一些改造的纤维素衍生物，微晶纤维素、CFll、CMC等均未表现出很强的诱导产生内切纤维素酶的能力，而且烟曲霉生长也比较缓慢，说明这些简单底物不适合烟曲霉的生长及产酶。 烟曲霉Y05粗酶作用于羧甲基纤维素(CMC)，30分钟内最适温度为65℃，最适pH为4.2，而对不溶性底物，如玉米芯、滤纸等在60分钟内最适温度为60℃，最适pH在4.4左右。Y05表现出比较强的耐酸活性，其最适pH比一般真菌产生的纤维素酶要低。 烟曲霉Y05粗酶表现出耐酸性，通过一系列分离纯化方法纯化了分子量为25kD的内切纤维素酶-EG25。EG25最适pH为3.2，比一般真菌纤维素酶低。pH稳定性很好，在pH2.2-7.2，EG25保持稳定，残余酶活力在80﹪以上，在pH6.2残余酶活力最高。EG25在pH2.2时仍然保持50﹪的活性，pH接近中性时，基本没有活力。在pn中性时活力很低并非不可逆失活造成，调整到最适pH，其仍然保留很高的残余活力。 通过LC/MS/MS鉴定，EG25为烟曲霉产生的糖苷水解酶12家族的内切酶，不含CBD，其估测分子量为25785-42。 1．2对EG25进行了同源模建和耐酸机制分析，发现了与GH12家族耐酸机制相关的氨基酸位点利用同源模建的MODELLER程序以．Aspergillus．niger Cell2A的晶体结构(1ks4A)为模板，进行了EG25的同源模建。通过序列比对，比较了EG25同Trichoderma reesei Cell 2A主要的氨基酸差异，发现Asn95-Asp95的改变发生在活性中心部位，可能与EG25的耐酸性相关。为进一步分析氨基酸序列与酶最适pH的机理关系提供了一定的参考。 1.3对烟曲霉胞外蛋白进行了双向电泳展示及胶内原位活性分析探索了固体发酵的烟曲霉胞外蛋白质组的分离纯化方法，并通过双向电泳对蛋白质组进行了展示，通过MALDI-TOF MS结合PMF方法对部分蛋白进行了鉴定，发现外切纤维素酶在分泌蛋白中占有重要地位，为进一步研究烟曲霉在固体发酵时胞外蛋白质组的变化情况提供了基础。 实验中，探索了双向电泳活性染色技术，发现在平衡过程中不添加碘乙酰胺对蛋白分离影响不大，而且蛋白在第二向SDS电泳中可以恢复活性。首次将纤维素酶活性染色技术应用到双向电泳中，得到了清晰，稳定，分散较好的复性斑点。活性染色技术的应用，扩展了双向电泳技术可提供的信息量，可以在蛋白鉴定中起重要的辅助作用。在活性染色电泳中，发现蛋白丰度过高不利于复性，因此本技术可能在分析低丰度蛋白，以及在分析天然环境样品中得到更好的应用。 2 天然腐败青贮纤维素酶与烟曲霉纤维素酶性质差异说明二者组成的差别烟曲霉在青贮样品中占有主要地位，比较青贮直接浸泡得到的粗酶液和烟曲霉固体发酵粗酶液，发现二者有很多相似之处，如二者均有耐热活性、最适温度都在65℃左右、在活性电泳中，有部分活性带位置非常相似。尽管青贮中存在其它纤维素降解微生物，烟曲霉作为其中主要真菌，产生的胞外纤维素酶肯定会在青贮胞外粗酶中占有重要地位。然而二者还有很多不同之处，如二者最适pH相差较大，烟曲霉为4.2，而青贮粗酶为5.8；两者在DEAE阴离子交换柱上的性质截然不同：另外，经分子筛分离后其各组分也表现出不同的耐热活性，这些都说明二者在纤维素酶系组成上有差别。显示了传统由微生物纯培养-纤维素酶分离方法的局限性。 2．1不依赖培养直接分离青贮纤维素酶组分的方法微生物的不可培养性是限制微生物资源利用的一个重要因素。微生物产生的蛋白是微生物与外界作用而维持自身生命活动的主要媒介，在某些情况下，可以处于一种天然富集的状态．因此提示我们直接从天然生境中分离纯化某些重要蛋白的可能性，以摆脱微生物可培养性的限制，此研究思路以前未见报道。本实验室前期工作中利用纤维素酶吸附性质从天然青贮中纯化了一个外切酶纯组分，在本部分工作中，我们又进一步利用常规柱层析的方法，从天然青贮样品中分离纯化了一个外切酶纯组分和几个内切酶，从而扩宽了这种不依赖培养的分离方法的应用范围。这一研究思路的提出，相比传统微生物利用方式是一个飞跃，有望对于不可培养微生物研究产生积极的促进作用。 2．2首次提出并建立了天然生境纤维素酶宏蛋白质组学的分析策略在本研究中，以青贮为实验对象，建立了复杂生境宏蛋白质组提取-纯化-双向电泳．活性染色/质谱鉴定的不依赖培养的纤维素酶分析方法。虽然此方法有待完善，但将天然生境作为一个有机的整体，考察其中所有存在的蛋白质，对于纤维素天然降解机制会有一个更加全面系统的了解。不依赖培养的蛋白纯化方法摆脱了传统分离方法对微生物可培养性的要求，可以更加真实的反映纤维素酶实际分布情况。双向电泳-活性染色．质谱鉴定方法搭建了高通量的筛选鉴定平台。