【摘 要】
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猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease,PCVD）可造成猪免疫器官损伤,引起猪免疫功能抑制或紊乱,每年该病会给养猪业造成严重的直接和间接经济损失。对猪有致病性的猪圆环病毒有猪圆环病毒2型（PCV2）、3型（PCV3）和4型（PCV4）。目前,PCV2和PCV3流行普遍,并且存在两者混合感染现象,但尚无PCV2-PCV3二联疫苗用于预防PCVD。猪圆环病毒的ORF2编码的
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猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease,PCVD）可造成猪免疫器官损伤,引起猪免疫功能抑制或紊乱,每年该病会给养猪业造成严重的直接和间接经济损失。对猪有致病性的猪圆环病毒有猪圆环病毒2型（PCV2）、3型（PCV3）和4型（PCV4）。目前,PCV2和PCV3流行普遍,并且存在两者混合感染现象,但尚无PCV2-PCV3二联疫苗用于预防PCVD。猪圆环病毒的ORF2编码的衣壳（Capsid,Cap）蛋白是诱导机体产生抗感染免疫的主要蛋白,也是疫苗研究的主要靶蛋白。本研究制备了 PCV2和PCV3二联病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）,旨在为将来PCV2和PCV3二联苗的研制提供技术支持。本研究首先通过PCR扩增,获得了两端带有核酸限制性酶切位点BamHⅠ/Sal Ⅰ和Xho Ⅰ/Kpn Ⅰ的PCV2Cap和PCV3Cap蛋白基因;将两个Cap基因分别连接到杆状病毒载体pFastBacTM Dual的PH和p10两个高效表达的启动子下游,构建了重组质粒;将重组质粒转化到含有杆状病毒穿梭载体的大肠杆菌DH10Bac中,在抗性培养平板上经两次蓝白斑筛选后得到可表达PCV2Cap-3Cap蛋白的重组杆粒rBC-PCV2Cap-3Cap。然后,将构建的重组杆粒转染到sf9昆虫细胞,进行病毒的拯救,通过PCR、Westernt blot和间接免疫荧光（IFA）等实验,证明了 PCV2和PCV3 Cap蛋白均得到表达。透射电镜下,表达的蛋白形成直径17 nm的圆形VLPs。最后,采用蔗糖密度梯度离心法纯化表达的Cap蛋白,并将其与等量弗氏佐剂乳化后,经皮下接种Balb/c小鼠（n=5）,80μg/200μL/只;同时设置对照组,接种等体积量PBS（n=3）。连续进行三次免疫。免疫前和免疫后每周采血,检测PCV2Cap和PCV3Cap蛋白抗体效价,三免后14天检测血清中的细胞因子。结果显示,PCV2-PCV3二联VLPs能够诱导机体产生PCV2和PCV3的特异性抗体;三免后14天免疫组的IL-2、IL-6和IL-10水平显著高于PBS组,IFN-γ水平显著低于PBS组。提示PCV2-PCV3二联VLPs能够诱导机体产生免疫应答。PCV2-PCV3二联VLPs的制备,为进一步研发PCV2-PCV3亚单位疫苗奠定了基础。
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