研究背景ILT4(免疫球蛋白样转录子4),也被称为淋巴细胞免疫球蛋白样受体2(LIR2)、单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体10(MIR-10)、或CD85d,该蛋白于1997年被发现,属于激活和抑制性免疫球蛋白样转录物家族(ILTs),参与调节免疫细胞的活化。正常生理状态下,ILT4主要在先天免疫细胞中表达,例如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)和粒细胞。免疫细胞表面的ILT4与配体结合后,可募集含有SH-2结构域的SHP-1或SHP-2磷酸酶,抑制钙动员,进而抑制这些细胞的激活信号。先天免疫细胞和内皮细胞中,ILT4的表达可被一些病理因素显著诱导,包括炎性细胞因子(IL-10、TGF-β、IFN-α、IL16或血小板生成素),与调节性T细胞(Treg)和间充质干细胞相互作用,免疫抑制药物(地塞米松、尼氟酸、雷帕霉素和白藜芦醇)、病原体感染和Toll样受体(TLR)信号传导。据报道,这些病理因素介导的ILT4异常或异位表达,可促进同种异体移植物排斥、自身免疫和感染性疾病的进展。虽然有关ILT4在免疫相关疾病作用方面的研究取得了重大进展,但其在肿瘤发生和进展中的作用仍未得到充分研究。最近的研究表明,ILT4在某些肿瘤的肿瘤细胞和相关基质细胞中高表达,包括白血病、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、食道癌和胰腺癌。相关研究表明,ILT4可能直接调节这些恶性肿瘤细胞的生物学行为。但是,ILT4在NSCLC中的作用及相关机制目前尚不明确。从结缔组织中分泌出来的MMPs(基质金属蛋白酶),是一组对细胞外基质具有降解功能的蛋白酶家族,MMPs家族中的各成员之间在结构上有很高的同源性。MMPs蛋白酶家族主要在人体伤口愈合、细胞外基质构成以及肿瘤侵袭、转移过程中发挥作用。其中MMP-2是MMPs家族中的一个重要成员之一,MMP-2不仅可对细胞外基质进行降解,同时对Ⅳ型胶原(基底膜的主要组成成分)也具有分解的作用,MMP-2在调节细胞迁移、促进肿瘤生长和血管生成等过程中发挥着重要的调节作用,为肿瘤浸润和转移创造更为合适的微环境。相关的研究结果表明,通过对多种肿瘤组织检测发现MMP-2在肿瘤组织中均呈现过度表达的状况,同时还证实MMP-2的表达状况与肿瘤的侵袭、转移及预后密切相关,对预测肿瘤转移和复发的风险具有重要意义。PI3K是磷脂激酶家族中的重要成员之一,依据PI3K在功能和结构上的差异,将其分为三种类型即Ⅰ、ⅠⅡ 和Ⅲ 型,目前为止,研究相对广泛的PI3K为Ⅰ型,再依据P13K和p1 10结合的亚基的区别,又可将Ⅰ型PI3K再次分为A和B两个亚型。由催化亚基即110α、p11Oβ、p1108和调节亚基(p85)组成IA型PI3K;IB型PI3K与IA型相比,其催化亚基为p110γ。PI3K与酪氨酸残基的蛋白(生长因子受体、连接蛋白、Ras蛋白)发生作用,使PI3K活化。激活后的PI3K诱导磷脂酰肌醇 4,5-双磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PIP2)磷酸化成为磷脂酰肌醇 3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PIP3),而AKT中的PH结构域则可与PIP3结合,使AKT1的催化结构域Thr308(AKT2的 Thr309,AKT3 的 Thr305)位点被磷酸肌醇依赖性激酶 1(phosphatidylinositol-dependent kinase l,PDK1)磷酸化,AKT1 的 C-末端疏水区域的Ser473、AKT2的Ser474和AKT3的Ser472位点被MTORC2磷酸化,从而激活AKT。p-AKT通过磷酸化结节性硬化复合体(tuberous sclerosiscomplex,TSC)1/2 促使 Rheb GDP 转化为 RhebGTP,从而激活 MTORC1,p70s6 激酶(p70s6 kinase,p70s6K)和真核起始因子 4E 结合蛋白 1(4E-bindingprotein 1,4E-BP1)表达上调。研究目的大量研究结果显示,ILT4在不同种类的恶性肿瘤中均呈现出高表达,ILT4异常高表达是导致肿瘤发生和发展的重要因素之一。但ILT4在非小细胞肺癌(NSCLC)侵袭和转移中的作用,以及相关的分子机制目前尚不明确。众多的研究表明,MMP-2和MMP-9在多种肿瘤尤其是NSCLC的侵袭和转移过程中起到了重要的作用。然而,ILT4是通过MMP-2还是MMP-9对NSCLC的侵袭和转移产生作用目前尚不明确。有鉴于此,本次研究首先通过免疫组化观察ILT4、MMP-2和MMP-9在NSCLC癌组织中的表达并分析相关性;再通过体外细胞实验,探究ILT4敲除对非小细胞肺癌侵袭和转移能力的影响,并进一步探讨ILT4敲除对相关机制的影响。研究方法1.采用免疫组织化学法在蛋白水平上验证在NSCLC患者癌组织中ILT4、MMP-2和MMP-9的蛋白表达情况;统计分析ILT4、MMP-2以及MMP-9在NSCLC癌组织及癌旁正常组织之间的表达差异,并分析ILT4与MMP-2和MMP-9表达的相关性。2.收集非小细胞肺癌患者的随访资料,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,应用log-rank检验分析ILT4的表达与患者生存时间之间的关系。3.使用si-ILT4通过Lipofectaemine 2000试剂转染入A549和域H1299细胞中,将A549和域H1299细胞中ILT4基因敲除。4.采用qRT-PCR法在基因水平检测A549和H1299细胞敲除ILT4后MMP-2和MMP-9的RNA水平差异。5.通过转染siRNA的方法,在体外细胞实验中,抑制NSCLC细胞系A549和H1299细胞中的ILT-4表达,并设定阴性对照组(转染空包载体)和未进行任何处理的正常对照,观察各组细胞的迁移能力、侵袭能力以及相关蛋白表达的水平。6.通过细胞迁移试验,分析ILT-4敲除后,在体外中,对两种非小细胞肺癌细胞迁移能力的影响。7.通过Transwell试验,分析ILT-4敲除后,在体外中,对两种非小细胞肺癌细胞侵袭能力的影响。8.采用Werstern Blot法对各组细胞中相关蛋白进行检测,分析ILT4敲除后,对相关信号通路的影响。9.si-ILT4转染入NSCLC细胞内,使用Lipofectaemine 2000将用于敲除ILT4的si-ILT4转染入A549细胞中,并观察对细胞形态是否存在影响。10.为了验证ILT4对NSCLC细胞系中A549细胞增殖的影响,采用MTT法检测NC、si-NC和si-ILT4各组细胞增殖率;11.为了探讨ILT4敲除后对A549细胞凋亡情况的影响,采用流式细胞实验对分别给予相应处理后的各组A549细胞进行细胞凋亡检测。同时对各组A549细胞的周期分布进行检测。12.采用Western Blot检测A549细胞中ILT4对PI3K-AKT信号通路相关蛋白以及下游的P53和MMP-2蛋白的影响。研究结果1.免疫组化实验结果显示,Ⅰ-Ⅱ 期和Ⅲ-Ⅳ期非小细胞肺癌患者癌组织中ILT4、MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平显著高于癌旁正常组织(P<0.05)。与Ⅰ-Ⅱ期NSCLC患者癌组织相比,ILT-4和MMP-2在Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者癌组织中的表达量显著增高(P<0.05)。然而,MMP-9在Ⅰ-Ⅱ 期和Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者癌组织中的表达无显著差异(P>0.05);2.生存分析结果显示,ILT4阳性表达患者预后总生存率显著低于ILT4阴性表达患者。3.细胞迁移试验结果显示,沉默A549和H1299细胞中ILT4基因可显著抑制A549和H1299细胞的迁移能力(P<0.05);此结果表明在NSCLC细胞系A549和H1299中ILT4为高表达,在沉默ILT4后,A549和H1299细胞的迁移能力得到显著的抑制。4.Transwell侵袭试验结果显示,沉默A549和H1299细胞中ILT4基因可显著抑制A549和H1299细胞的侵袭能力(P<0.05);5.qRT-PCR结果显示,沉默ILT4基因的A549和H1299细胞较两种对照细胞其ILT4和MMP-2的基因水平显著下降(P<0.05),而MMP-9的基因水平无显著性差异(P>0.05)。6.免疫印迹试验结果显示,沉默ILT4基因的A549和H1299细胞较对照细胞其ILT4和MMP-2的蛋白表达量显著下降(P<0.05),而MMP-9的蛋白表达量无显著性差异(P>0.05);7.在A549细胞中将ILT4沉默后,A549细胞增殖率受到显著抑制;而A549细胞凋亡率伴随着A549细胞大量滞留在G1期而显著升高;8.在A549细胞中将ILT4沉默后,伴随着A549细胞生物活性(增殖、侵袭和迁移)的降低,PI3K-AKT信号通路得到显著抑制;同时下游的P53蛋白表达显著升高的同时MMP-2蛋白表达水平显著降低。结论1.ILT4是诱导非小细胞肺癌转移和侵袭的主要因素之一。ILT-4的诱导作用可能通过上调MMP-2的表达量实现,而与MMP-9的表达量无明显相关性。ILT-4是具有判断非小细胞肺癌患者预后的一个潜在诊断指标。2.ILT4在非小细胞肺癌癌组织中呈高度表达,并且ILT4的表达量与非小细胞肺癌临床分期密切相关,二者之间呈正相关。ILT4可以作为晚期或转移性非小细胞肺癌患者的诊断生物标志物和治疗靶标。3.ILT4沉默后,非小细胞肺癌细胞系A549细胞、H1299细胞的侵袭和迁移能力受到显著的抑制;4.ILT4沉默后具有的抑癌作用可能是通过抑制MMP-2蛋白活性实现;5.ILT4沉默后对非小细胞肺癌的生物活性具有明显的抑制作用,其作用机制可能与ILT4正向调控PI3K-AKT信号通路相关。