鱼腥藻7120碱性磷酸酶AP<'A>(all2843)结构与功能的研究

来源 :中国科学院武汉病毒研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:vensen_guo
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本研究通过一系列生物学手段系统阐述了鱼腥藻7120基因all2843编码的碱性磷酸酶ApA的生物化学特征,并鉴定了酶当中的关键氨基酸。结果表明体外表达的ApA是一个分子量为72KDa的单体酶,其最适pH值和温度分别为11.5和500℃左右。ApA的热稳定性不佳,在低温下稳定,但在50℃处理10min后完全失活;储存实验表明,ApA在4℃下10周,-20℃下4个月活性无明显丧失。ApA可被Mg2+和Co2+激活。电感耦合等离子原子发射光谱结果表明ApA是一种含有Mg2+和Zn2+的蛋白,二者以1:2的比率结合于酶中。分别在高浓度磷酸受体和低浓度磷酸受体条件下对纯化的ApA进行了动力学分析,显示APA具有较低的Km和Ki。通过定点突变得到了14个突变,对这14个突变的酶活性分析的结果及与大肠杆菌碱性磷酸酶比对的结果表明,165S和229R分别为ApA的催化位点和底物结合位点,216H、218T、445E、460D、461W、464H、505D、506H、566H是ApA催化的关键位点。突变的结果还显示尽管其所处位置保守,但25D不是ApA的关键氨基酸。   对鱼腥藻7120进行缺磷培养,通过测定培养物酶活,证明在缺磷培养时,鱼腥藻7120的碱性磷酸酶活性提高。运用反转录PCR和实时定量反转录PCR,证明鱼腥藻7120在缺磷培养时,基因all2843和alr5291的转录均受到磷胁迫的诱导上调。  
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