人体内有两个基因组,一个是由父母遗传得到的人体基因组,另一个则是出生以后才进入人体、尤其是肠道内的共生微生物,称为“人体第二基因组”。两个基因组相互协调,维持人体的健康。肠道菌群不仅协助宿主摄取营养物质和能量,在病原体抵抗和免疫调节方面也起着重要的作用。抗生素可能干扰人体的各种生理功能,引起急性或慢性疾病。早期,传统研究方法分辨率低以及成本高昂,大大地限制了研究者对抗生素干扰肠道微生物的认识。随着高通量深度测序技术的发展以及新的微生物种系聚类方法的建立,突破了传统方法的瓶颈,揭示了肠道菌群的“罕见生物圈”。本课题组前期建立了通过Illumina双末端测序16S rRNA标签序列分析微生物群落的新方法(BIPES),并建立了新的序列聚类工具TSC,可以高效低成本地分析微生物群落。通过连续15天灌胃给药的方式比较黄连素、环丙沙星和甲硝唑三种用于治疗感染性腹泻的抗微生物药物对小鼠肠道微生物组多样性的影响,并阐述三种抗微生物药物对小鼠肠道菌群的作用特点。同时,以连续20天灌胃给药的方式,通过Illumina高通量测序技术分析阿奇霉素和罗红霉素对小鼠肠道微生物组多样性的影响,比较阿奇霉素和罗红霉素对小鼠肠道菌群作用的异同。目的：1、通过连续15天灌胃给药的方式比较用于治疗感染性腹泻的黄连素、环丙沙星和甲硝唑三种抗微生物药物对小鼠正常肠道微生物组多样性的影响,阐述三者对小鼠肠道菌群的作用特点,为黄连素、环丙沙星和甲硝唑对肠道细菌影响及临床用药等研究提供一定的数据基础。2、通过连续20天灌胃给药,比较阿奇霉素和罗红霉素对小鼠正常肠道菌群α和β多样性的影响,为罗红霉素和阿奇霉素的临床用药和肠道副作用研究提供一定的数据基础。方法：1、实验一将32只雄性BALB/C小鼠随机分为4组(8只/组),保证每组小鼠的体重分布相一致,即黄连素组(BBR)、环丙沙星组(CIP)、甲硝唑组(MNZ)和对照组(CK)。本实验分为四个时期,分别是给药前期Ⅰ(3天)、灌胃期Ⅱ(5天)、给药期Ⅲ(15天)和停药期Ⅳ(40天)。黄连素组(BBR),小鼠给药剂量为0.100g每千克体重。环丙沙星组(CIP),小鼠给药剂量为0.072g每千克体重。甲硝唑组(MNZ),小鼠给药剂量为0.216g每千克体重。对照组(CK),灌胃0.20毫升ddH2O。四组的灌胃频率为每天上午灌胃一次。所有粪便样品在灌胃前收集。对所收集的粪便样品,每管称取出10mg,加入50-65μl的去离子水,采用煮沸法提取总DNA。针对所有粪便样品的16S rRNA V6区进行PCR扩增。把PCR产物进行Illumina测序前,首先,用凝胶分析软件BandScan进行相对定量,确定不同组别每个样品PCR产物的加入量,然后,将包括标准品在内的所有PCR产物,并按组别混合。其次,对各组样品的混合PCR产物用Invitrogen荧光定量仪进行绝对定量,最后,根据各组别样品PCR产物的绝对定量和计划测序深度对各组PCR产物进行混合,并加入4个标准品,作为外标样品,以评估高通量深度测序的误差。然后,将总PCR产物经Illumina HiSeq2000测序仪进行PE100-bp测序。经Illumina HiSeq2000测序后得到高通量数据,采用生物信息学分析方法对数据进行分析。首先,采用BIPES流程(Perl语言编写,专用于分析高通量测序数据的流程)处理原始序列。包括四步,第一步,拼接序列。根据每个样品引物上的Barcode识别双末端测序的原始序列,用Perl脚本语言把双末端测序序列分别放入FQ文件1和2里,然后采用Needleman-Wunsch (NW)算法进行全局比对,对V6区片段进行拼接,拼接过程中,发生错配时,根据序列测序质量沿着5’-3’逐渐下降,我们选择靠近5’端的碱基为准。第二步,去除引物,得到16S rRNA V6片度。第三步,质量控制。通过对标准品计算测序错误率,对本次测序精确率进行初步评估。评估合格后,我们会去除一个或多个模糊不清的序列(N)；去除引物上含有任何错误的序列；去除在40-70位点发生一个以上碱基错配的序列；去除拼接序列长度小于50-bp和大于90-bp的序列。第四步,将得到的干净序列用UCHIME筛选嵌合体并去除嵌合体序列。其次,采用分阶段聚类算法Two-Stage-Clustering (TSC)将干净序列聚类成操作分类单元(OTUs),出现频率大于等于3次的序列采用严格的分层聚类算法,NW距离采用最远距离法；出现频率小于3次的序列采用贪婪聚类算法,NW距离采用最远距离法。TSC聚类方法保持对高丰度序列高精确度聚类,同时也保持低丰度序列的多样性,从而达到缓和测序与PCR错误的作用。最后采用Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)算法对OTUs进行分类。采用UCLUST算法计算得到a多样性指数。根据UniFrac距离,采用QIIME进行主成分分析。采用LefSe在线工具追踪不同组别中特殊的微生物物种,并采用非参数秩和检验算法进行统计分析。其余所有的统计分析均采用SPSS17.0进行分析。2、实验二将24只雄性BALB/C小鼠随机分为3组(8只/组),保证每组小鼠的体重分布相一致,即罗红霉素组(POX)、阿奇霉素组(AZI)和对照组(CK)。本实验分为四个时期,分别是给药前期(3天)、灌胃期(5天)、给药期(20天)和停药期(30天)。罗红霉素(ROX)组,小鼠给药剂量为0.043g每千克体重。阿奇霉素(AZI)组,小鼠给药剂量为0.072g每千克体重。对照组(CK),灌胃0.2毫升ddH2O。三组的灌胃频率为每天上午灌胃一次。所有粪便样品在灌胃前收集。DNA提取、PCR扩增、PCR产物质控测序、PCR产物测序和数据分析与“实验一"相同。结果：1、实验一1.1一共收集560个粪便样品,经BIPES流程分析得到2921901条序列,质控后得到2602251条序列,采用UCHIME剔除嵌合体后得到2578873条序列,unique后序列有847909条,最后经TSC聚类得到122436个OTUs。通过对所有样品归一化后,运用PERL脚本程序得到Shannon多样性指数,Shannon多样性指数显示黄连素、环丙沙星和甲硝唑均降低小鼠肠道菌群丰度和均度,降低小鼠肠道菌群α多样性以甲硝唑最强烈,黄连素次之,环丙沙星最低。停止口服黄连素和环丙沙星,肠道菌群α多样性恢复至对照组水平,停止口服甲硝唑1个月,肠道菌群α多样性仍不能恢复至对照组水平。值得注意的是,口服黄连素第2天后,Shanon指数开始恢复,与之对应的,口服甲硝唑第4天后,Shanon指数开始恢复。1.2所有粪便样品经Illumina测序后得到原始序列,经过TSC聚类和GAST分类得到OTUs,提取OTUs代表序列与参考数据库比较得到UniFrac距离,采用QIIME对距离进行主成分分析得到聚类结果。未加权的PCoA结果显示,给药期间黄连素组和甲硝唑组样品与对照组明显地分离,环丙沙星组样品和对照组没有完全分离。口服黄连素、环丙沙星和甲硝唑对小鼠肠道菌群结构的影响程度不一,甲硝唑最强烈,黄连素次之,环丙沙星最弱。停止口服环丙沙星3周,肠道菌群结构恢复至对照组水平,停止口服黄连素1个月,肠道菌群结构恢复至对照组水平,停止口服甲硝唑1个月,肠道菌群仍不能恢复至对照组水平。其次,加权与未加权的PCoA结果非常相似,给药期间,除了环丙沙星组外,黄连素组和甲硝唑组与对照组的样品明显地分离,这说明了口服黄连素、环丙沙星和甲硝唑主要影响小鼠肠道菌群结构高丰度的OTUs,与之对应,对低丰度OTUs影响较少。1.3所有样品可以分类到39个样品,其中98.86%的序列集中在厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)。口服黄连素和甲硝唑均促使小鼠肠道菌群的厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)减少,变形菌门(Proteobacteria)增加。口服环丙沙星,厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)无明显变化。停止口服黄连素、环丙沙星和甲硝唑,放线菌门(Actinobacteria)反而增加。值得注意的是,黄连素和环丙沙星干扰,拟杆菌门(Bacteroedetes)无明显变化,甲硝唑干扰可使拟杆菌门明显下降。1.4变形菌门纲水平上,口服甲硝唑过程中,γ-变形杆菌(Gammaproteobacteria)和p·变形杆菌(Betaproteobacteria)增加,其中,γ-变形杆菌(Gammaproteobacteria)增加最显著。口服黄连素过程中,γ-变形杆菌(Gammaproteobacteria)和p-变形杆菌(Betaproteobacteria)增加最显著,增加幅度远小于甲硝唑。口服环丙沙星期间,变形菌纲无明显变化。许多重要的病原菌属于γ-变形杆菌纲(Gammaproteobacteria),甲硝唑组的γ-变形杆菌纲增加最显著,增加幅度最高为39.47%,整个给药期,平均增加幅度维持在29.54%,停止口服甲硝唑,γ-变形杆菌纲逐渐减少,平均增加幅度维持在9.34%。这为口服甲硝唑增加病原菌定植风险提供了一定的数据支持。1.5选取丰度最高的前十位细菌属,计算这十种细菌属占总细菌属的百分比。属水平分布图显示,口服黄连素,小鼠肠道菌群中埃氏菌(Escherichia)、拟杆菌(Bacteroides)、乳杆菌(Lactobacillus)、parabacteroides丰富度增加,嗜胆菌(Bilophila)和埃格特菌(Eggerthella)丰富度减少。停止口服黄连素,以乳杆菌(Lactobacillus)显著性增加为主,其他细菌逐渐恢复。与环丙沙星和甲硝唑相比,给药期和停药期间,拟杆菌(Bacteroides)和乳杆菌(Lactobacillus)显著增加,未观察到新的细菌增加或定植,这是黄连素对小鼠肠道菌群作用最有代表性的特点。口服环丙沙星,小鼠肠道菌群中拟杆菌(Bacteroides)和Parabacteroides丰富度增加,螺杆菌(Helicobacter)和Papillibacter丰富度减少,细菌发生变化幅度并不显著。停止口服环丙沙星,以乳杆菌(Lactobacillus)、埃格特菌(Eggerthella)、和Alstipes反弹性增加为主,其他细菌属逐渐恢复。口服甲硝唑,小鼠肠道菌群中埃氏菌(Escherichia)、肠球菌(Enterococcus)和类芽孢杆菌(Paenibacillus)丰富度增加,拟杆菌(Bacteroides)、埃格特菌(Eggerthella)、Alistipes、Papillibacter、嗜胆菌(Bilophila)、Sporobacter丰富度减少。停止口服甲硝唑,以拟杆菌(Bacteroides)、乳杆菌(Lactobacillus)、埃格特菌(Eggerthella)和Alistipes反弹性增加为主。与黄连素相比,口服甲硝唑1周后开始,小鼠肠道菌群结构开始恢复,除了原有的细菌恢复外,发现新的细菌属出现和增加,在给药期第4天,观察到类芽孢杆菌(Paenibacillus)和梭菌属(Clostridium)新出现并持续增加,梭菌属增加详见LEfSe结果部分。1.6采用LEfSe对小鼠肠道差异性细菌进行统计分析,结果显示,口服黄连素过程中,一共有8组细菌增加,为小鼠肠道菌群丰富度增加的细菌标志物,具有统计学意义,LDA值为2.0。8组细菌分别为埃希菌属(Escherichia)(从门到属)、拟杆菌属(Bacteroides)(从科到属)、乳杆菌属(Lactobacillus)(从纲到属)、肠球菌属(Enterococcus)(从纲到属)、Sporobacter、Parabacteroides和Bryantella。与之对应,一共有5组细菌减少,即嗜胆菌属(Bilophila)、 Eggerthella(从门到属)、Alistipes(从科到属)、Mucispirillum(从门到属)、普氏菌(Prevotella)(从科到属)和Allobaculum。口服环丙沙星,一共有7组细菌增加,即拟杆菌属(Bacteroides)(从科到属)、Parabacteroides、Sporobacter、毛螺菌属(Lachnospira)、不动杆菌属(Acinetobacter)(从门到属)、葡萄球菌属(Staphylococcus)从纲到属)和莫拉菌属(Moraxella)(从纲到属)。与之对应,有2种细菌减少,它们分别是Astipes(从科到属)和Anaerotruncus，其减少的幅度不显著。口服甲硝唑,一共有4组细菌增加,即埃希菌属(Escherichia)(从门到属)、肠球菌属(Enterococcus)(从纲到属)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)和梭菌属(Clostridium)(从科到属)。与之对应,一共有5组细菌减少,即拟杆菌(Bacteroides)、Alistipes(从门到属)、嗜胆菌属(Bilophila)(从纲到属)、Mucispirillum(从门到属)和Papillibacter(从门到属)。1.7梭菌(Clostridium)、肠球菌(Enterococcus)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的大多数细菌是引起院内感染的致病菌,是增加院内感染风险的主要原因之一。给药期,甲硝唑组的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)持续增加,平均增加幅度约为29%,最高增加幅度为39%,停止甲硝唑给药2周内,肠杆菌科增加幅度下降,最高增加幅度也达到34%,停止甲硝唑给药2周后,肠杆菌科恢复至对照组水平。黄连素组,在给药期间第1-5天,肠杆菌科也持续增加,但增加的幅度远小于甲硝唑组,最高增加幅度仅为20%,值得注意的是,给药期的第五天后和停药期,肠杆菌科基本上不增加。给药过程中,甲硝唑组的肠球菌(Enterococcus)也同样持续增加,最高增加幅度为20%,黄连素仅在给药期的第1-2天增加,其余时间点,肠球菌无明显增加。在给药期的1周后,甲硝唑组的梭菌(Clostridium)突然出现并增加,一直持续至停药后第4天。黄连素组的梭菌没明显变化。由Shannon指数、PCoA结果和科属水平分析结果可知,甲硝唑组在给药期的1周后,小鼠肠道菌群开始恢复,除了原来的细菌的数量和种类得到恢复外,出现了新的细菌增加,即类芽孢杆菌(Paenibacillus)和梭菌(Clostridium)。黄连素在给药期的1周后,小鼠肠道菌群也开始恢复,但是,黄连素组没有出现新的细菌增加,仅仅是原来的细菌数量和种类恢复。环丙沙星组的梭菌(Clostridium)、肠球菌(Enterococcus)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)均无明显的增加,环丙沙星能够很好的抑制梭菌、肠球菌和肠杆菌科细菌增加,有效地阻止梭菌、肠球菌和肠杆菌科细菌在小鼠肠道定植。2、实验二2.1一共收集了396个粪便样品,经过Illumina测序后,采用BIPES流程分析得到2969614条序列,质控后得到2636857条干净序列,采用UCHME剔除嵌合体后得到2601081条序列,unique后的序列有989026条,最后经TSC聚类得到181282个OTUs。通过对所有样品归一化后,运用QIIME工具计算,得到Shannon多样性指数和Observed OTUs,结果显示罗红霉素和阿奇霉素对小鼠肠道菌群的α多样性的作用是相似的。口服罗红霉素和阿奇霉素,小鼠肠道菌群丰度和均度降低,而且具有较长的后效应。停止口服罗红霉素和阿奇霉素1个月,肠道菌群α多样性不能恢复至原来的状态。2.2从β多样性的角度,罗红霉素和阿奇霉素长期给药对小鼠肠道菌群p多样性的作用是相似的,罗红霉素和阿奇霉素长期给药使肠道菌群结构发生显著改变。未加权的PCoA结果显示,给药期和停药2周内,大环内酯类抗生素组和对照组样品明显分离。停止口服罗红霉素和阿奇霉素,处理组样品与对照组的UniFrac距离逐渐减少,停止给药1个月,小鼠肠道菌群结构仍未完全恢复。加权的PCoA结果显示,给药期和停药期,罗红霉素组、阿奇霉素组和对照组样品交织在一起,说明了口服罗红霉素和阿奇霉素对小鼠肠道菌群高丰度OTUs影响较小。2.3所有样品可以分类到40个菌门,其中98.5%序列集中在厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)。从门水平角度,口服罗红霉素和阿奇霉素过程中,厚壁菌门增加,拟杆菌门和变形菌门减少。不同的是,停止口服阿奇霉素,厚壁菌门继续增加,变形菌门继续减少。2.4选取丰度最高的前十位细菌属,计算这十种细菌属占总细菌属的百分比,属水平分布图结果显示,口服罗红霉素期间,以埃氏菌(Escherichia)、 Alistipes、Parabacteroides、和Anaerotruncus增加为主,与之对应,拟杆菌属(Bacteroides)和嗜胆菌(Bilophila)丰富度减少。口服阿奇霉素期间,以Parabacteroides、Papillibacter和Alistipes增加为主,与之对应,拟杆菌属(Bacteroides)、嗜胆菌(Bilophila)和乳杆菌(Lactobacillus)丰富度减少。2.5采用LEfSe对罗红霉素组和对照组的差异性菌属进行统计分析,LDA值设置为2.0。在属水平,罗红霉素干扰过程中,以埃希菌属(Escherichia)(从纲到属)、Anaerotruncus和Anaerostipes(从门到属)增加为主,与之对应为,拟杆菌属(Bacteroides)(从门到属)、嗜胆菌属(Bilophila)(从门到属)、Anaerovorax(从科到属)、螺杆菌属(Helicobacter)(从门到属)、Faecalibacterium、普氏菌属(Prevotella)(从门到属)、Mucispirillum(从门到属)、Bulleidia(从门到属)、Eggerthella(从门到属)和Odoribacter(从门到属)显著减少。对阿奇霉素组和对照组的差异性菌属进行统计分析,LDA值设置为2.0。在属水平,阿奇霉素干扰过程中,以Parabacteroides、Papillibacter(从门到属)、Alistipes(从科到属)和Bryantella(从门到属)增加为主,与之对应,拟杆菌属(Bacteroides)(从门到属)、嗜胆菌属(Bilophila)(从门到属)、乳杆菌属(Lactobacillus)(从纲到属)、Mucispirillum(从门到属)、螺杆菌属(Helicobacter)(从门到属)和普氏菌属(Prevotella)(从门到属)显著性减少。结论：1.1甲硝唑引起小鼠肠道菌群α和β多样性降低幅度最大,黄连素次之,环丙沙星最小。停止口服黄连素和环丙沙星1个月,肠道菌群α和β多样性恢复正常,甲硝唑则不能恢复至正常。1.2甲硝唑对小鼠肠道菌群干扰作用最强烈而肠道菌群的恢复力最弱,以埃氏菌、肠球菌、类芽孢杆菌和梭菌增加为主,类芽孢杆菌和梭菌是肠道菌群恢复过程中新定植并增加的细菌,引起院内感染相关致病菌定植。1.3黄连素对小鼠肠道菌群的干扰作用小于甲硝唑,菌群恢复力却大于甲硝唑,黄连素具有独特的作用特点,黄连素干扰过程中,拟杆菌和乳杆菌显著增加。停止黄连素干扰后,小鼠肠道固有细菌的数量和种类开始迅速恢复。1.4环丙沙星对小鼠肠道菌群无显著性影响,恢复力比甲硝唑和黄连素强,未观察到院内感染致病菌富集,以拟杆菌增加为主,从保护正常肠道菌群角度,环丙沙星优于黄连素,黄连素优于甲硝唑。2.1罗红霉素和阿奇霉素长期给药对小鼠肠道菌群的α和β多样性的影响是相似的。2.2口服罗红霉素和阿奇霉素,小鼠肠道菌群的α多样性降低,肠道菌群结构也发生显著性改变,以拟杆菌减少为主。停止给药一个月,肠道菌群仍不能完全恢复到原来的水平,具有很长的后效应。