【摘 要】
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目的:为了对丹参药材质量进行有效地控制,本研究拟建立基于乙酰胆碱酯酶（AchE）的中空纤维靶标捕获法,并结合高效液相色谱法用于丹参药材中治疗心脑血管疾病的活性成分的筛选;从新溶剂和新材料角度出发,拟制备并采用新型萃取剂,以克服液相微萃取中传统有机溶剂毒性大且萃取效率有限的缺点,对已筛选出的活性成分富集和纯化并进行定量分析。方法:在由丹参提取液稀释得到的样品相中,放入提前制备好的靶标纤维,模拟体内生
【基金项目】
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国家自然科学基金“基于中空纤维细胞/靶标捕获和液相微萃取的中药Q-markers辨析新方法研究（编号:81973287）”；
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目的:为了对丹参药材质量进行有效地控制,本研究拟建立基于乙酰胆碱酯酶（AchE）的中空纤维靶标捕获法,并结合高效液相色谱法用于丹参药材中治疗心脑血管疾病的活性成分的筛选;从新溶剂和新材料角度出发,拟制备并采用新型萃取剂,以克服液相微萃取中传统有机溶剂毒性大且萃取效率有限的缺点,对已筛选出的活性成分富集和纯化并进行定量分析。方法:在由丹参提取液稀释得到的样品相中,放入提前制备好的靶标纤维,模拟体内生理环境,恒温搅拌筛选。运用单一变量法优化影响筛选的主要因素,并在最佳筛选条件下进行方法学考察,通过HPLC-UVD分析,初步鉴定丹参药材中治疗心脑血管疾病的活性成分。初步确定丹参治疗心脑血管疾病的活性成分后,我们将二乙醇胺和己酸所制备的可切换亲水低共熔溶剂作为萃取剂加入到样品相溶液中,涡旋萃取后,加入无机酸改变萃取相的溶解性,离心后收集疏水上层溶液进样分析;试验考察并优化了影响萃取性能的因素,利用傅里叶变换红外光谱对亲水性低共熔溶剂和回收的疏水上层溶剂的结构进行了表征;并将所建立的样品前处理方法与其他已发表的方法进行比较,以进一步证实该方法的可行性。结果:基于靶标乙酰胆碱酯酶的最佳试验条件:中空纤维种类为聚丙烯（内径:0.6mm,孔径:0.2μm）,壁孔溶剂为辛醇,样品相体积为6 mL、pH 5.7,靶标浓度为1 mg/mL、pH 6.5,筛选温度37℃,筛选时间90 min,样品相中四种活性化合物的浓度（以保留时间最小的二氢丹参酮I为基准）依次为5μg/mL、20μg/mL、11μg/mL、22μg/mL。在最佳实验条件下（270和286 nm）,捕获的活性化合物分别为二氢丹参酮I（tR17.467）、隐丹参酮（tR20.285）、丹参酮I（tR20.927）、丹参酮IIA（tR24.902）,不同产地同种药材中的某一活性成分结合能力相似。基于可切换低共熔溶剂液相微萃取方法的最佳试验条件:萃取剂为摩尔比1:1的二乙醇胺-己酸180μL,相转换剂为5 mol/L的盐酸溶液200μL,涡旋萃取时间20 s。在此条件下,二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA富集倍数分别为274、261、59和236;除丹参酮IIA的线性范围为0.003-0.6μg/mL外,其余三者的线性范围均为0.005-0.9μg/mL;检测限和定量限分别在0.5-0.7ng/mL和1.5-2.1 ng/mL之间;日内和日间精密度相对标准偏差分别为0.7%-8.6%和0.5%-5.8%;平均回收率94.6%-104.6%。该方法结合HPLC-UVD测得丹参中四种成分的含量分别为0.58、1.52、1.42和2.02 mg/g。结论:本文建立了基于AchE的中空纤维靶标捕获法,结合HPLC-UVD对丹参药材中治疗心脑血管疾病的物质基础进行筛选,指认了四种活性成分;制备了一种新型可切换亲水性DES,并将其成功应用于微萃取操作中对丹参四种活性成分的分离和富集,拓展了可切换溶剂的种类,为复杂样品分析提供了更为简便、高效、绿色环保的前处理方法。
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