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目的:
本研究旨在通过动物实验确定睫状体平坦部滤过术对慢性兔高眼压模型的降眼压疗效及视神经保护作用,评价该手术的有效性和对眼内组织的安全性。为临床该手术的应用提供客观依据和指导,进而为青光眼的治疗提供新的思路和方法。并分离、鉴定实验兔视网膜差异蛋白,从蛋白水平进一步验证手术的有效性和安全性。
方法:
1.慢性高眼压兔模型的研究:应用复方卡波姆溶液前房注射建立慢性实验性兔高眼压模型,观察术后眼压及眼部并发症,进行眼前节及眼底照相,超声生物显微镜(UBM)观察兔眼房角、前房等眼内组织的变化。
2.睫状体平坦部滤过术治疗慢性高眼压模型的研究:对卡波姆诱导的慢性高眼压兔1周后行手术治疗,观察术后眼压及眼部并发症；超声生物显微镜(UBM)观察术后结膜瓣、睫状体、滤过泡、滤过通道、玻璃体等组织变化。利用组织病理学光镜技术观察术眼滤过泡、视神经、视网膜的组织形念学改变。
3.蛋白质组学研究:提取正常组、高眼压组和手术组视网膜,利用双向凝胶电泳(2-DE)分离到视网膜蛋白质组中的蛋白点,通过比较2-D胶上点的变化,对有明显差异的点进行质谱鉴定,查询差异蛋白的种类和功能,评价其在高眼压状态下及睫状体平坦部滤过术后的作用与关系。
结果:
1.慢性高眼压兔模型的实验研究
1.1眼压
眼压升高时间:高眼压组眼压升高时间9天左右(8.5±4.3)天,大部分在1周至2周时眼压升高。其中,4眼在3天内升高,34眼在1周左右升高,20眼在2周左右升高,1眼在2周时仍来升高,再次造模后2周时升高。1例造模3次均未升高,造模成功率96.7％。1例眼压在第4天升高后未再下降,虽已发生晶状体脱位,但高眼压持续6月,6个月时眼压仍维持在24mmHg左右。
高眼压维持时间:高眼压状态持续20至60天左右。再次造模后高眼压持续20天左右,一般需3—5次重复造模。重复造模后高眼压持续时间较第一次短,约15—20天左右。反复造模眼压升高幅度变小,最后一次造模眼压维持在22—24mmHg左右。6眼共造模5次。
高眼压水平:高眼压平均持续20～60天,60天以后大部分经过反复造模维持高眼压状态,故只统计术后3天至60天的平均高眼压水平。术后3天平均24.0±0.8 mmHg；术后7天为25.2±3.4 mmHg；术后15天32.5±9.4 mmHg；术后30天为30.3±7.1 mmHg；术后45天为27.3±8.5 mmHg；术后2个月为24.8±7.2 mmHg。最高眼压为46 mmHg。
1.2 UBM观察
观察高眼压组10眼。1个月时,10眼均见卡波姆阻塞前房角,周边虹膜与角巩膜相贴,房角圆钝、关闭。角膜水肿,瞳孔散大。3个月时,10眼眼轴明显增长,前房加深,房角圆钝,虹膜膨隆。角膜水肿、粗糙,1例晶体脱位。6个月时,10眼房角关闭,角膜增厚,前房深。因瞳孔持续散大,虹膜回缩。2眼晶体脱位。
2.睫状体平坦部滤过术治疗慢性实验性兔高眼压的研究
2.1眼压对比结果:
30眼行睫状体平坦部滤过术后眼压下降明显。术后第3天平均眼压8.3±4.1mmHg,1例术后第3天眼压31mmHg,术后1周降至正常。术后1周平均眼压9.5±3.9mmHg,2例因术中出血,眼压升至17mmHg,1例术后第3天眼压31mmHg,术后一周降至13mmHg。1例术后1周行B超检查时压迫手术切口致前房出血。术后半个月10.4±3.9 mmHg。术后1月平均眼压10.9±4.0 mmHg,1例因行B超导致的前房出血仍存在,部分吸收。术后3月11.4±4.3 mmHg。术后6个月13.3±3.3 mmHg。手术组与高眼压组眼压在术后3天至60天有统计学意义。
2.2并发症
术中:30眼手术操作顺利。8例切除睫状体平坦部后有玻璃体溢出,其中4例有少量渗血随玻璃体溢出。1例术中前房出血。1例因术中咳嗽,在切除睫状体组织后脉络膜上腔出血,急关闭切口、缝线缝合。
术后:1例术后第3天前房积血。1例术后第7天行B超检查时压迫手术切口致前房出血。
2.3手术组UBM结果:
术后3天:观察24眼,23眼均可见前房细点状回声,滤过泡隆起,滤过内口缺损,滤过通道清晰可见。1眼未见明显的滤过泡。术后15天:24眼中,23眼均可见前房细点状回声减低,滤过泡隆起,滤过内口缺损,滤过通道清晰可见。1例眼压过低,未见明显滤过通道。术后30天:24眼中,22眼均可见明显的滤过内口及滤过道；1例球结膜增厚,滤过泡内口可见,未见明显滤过泡及滤过通道。1例滤过内口模糊。术后60天:观察18眼,16例可见明显的滤过泡及滤过道；2例滤过泡隆起不明显,滤过道模糊。术后90天:观察10眼,8眼可见明显滤过内口及滤过道；1眼滤过泡瘢痕化,1眼未见明显的滤过道,并有玻璃体牵拉。术后180天:观察5眼,3眼可见滤过泡隆起、较前扁平、壁厚,滤过内口缺损,滤过道通畅、较前狭窄。2眼未见明显的滤过内口及滤过道,其中1眼玻璃体牵拉。
3.光镜下视网膜组织形态学观察
①正常兔视网膜组织学观察:正常组视网膜神经纤维层较稀疏,水平排列,较规整；神经节细胞层大多呈单层排列。胞核较大,排列整齐；内网状层为疏松的网状结构,厚度约为内核层两倍；内核层由3～5层细胞构成,胞核较大,染色稍深,排列整齐,厚度约为外核层的2/3,外网状层薄,网状结构也不如内网状层明显。外核层较厚,由8～10层细胞组成。胞核小,染色深,排列紧密。视锥视杆细胞层呈规则的毛刷状,色素上皮层为排列整齐的单层视网膜色素上皮细胞。
②高眼压组:高眼压30天后视网膜既有明显的病理损害,主要表现为神经节细胞数目减少,细胞变性,空泡形成和核固缩现象多见。神经纤维层、内网状层、内核层轻度变薄,内核层细胞排列紊乱,外核层变化不明显。在高眼压作用下,随时间延长视网膜各层厚度及细胞数目进一步减少。3个月时视网膜萎缩改变明显,神经节细胞数目明显减少,内网状层变薄,内核层细胞排列紊乱,外核层变化不明显。6个月时神经节细胞数目进一步减少,细胞空泡化。神经纤维层厚度(RNFL)仅为正常组的1/3。对神经纤维层厚度做统计学比较:高眼压组1个月、3个月、6个月与正常组对比均有显著性差异。
③手术组:术后1～6个月神经纤维层厚度略有减少,但内核层和节细胞层细胞排列比较规整。术后6个月时神经节细胞偶见空泡化。对神经纤维层厚度做统计学比较:手术组和正常组比较在术后1个月和3个月统计学无明显差异(P>0.05),术后6个月有统计学差异(P<0.05)。手术组和高眼压组对比在术后1个月、3个月、6个月均有显著统计学差异(P<0.01)
4.蛋白质组学研究
成功鉴定出8个蛋白质。其中高眼压组与正常组和手术组对比表达升高的蛋白质有2个；表达降低的蛋白质有6个。对其中对4个蛋白质做论述:巨噬细胞移动抑制因子、酰基辅酶A结合蛋白、鸟苷酸结合蛋白、线粒体ATP酶。初步分析这4个蛋白质可能参与了青光眼损伤修复、免疫调控、信号转导、抗氧化应激等过程。
结论:
1.复方卡波姆前房注射可成功诱导慢性实验性高眼压模型,经过重复注射可维持稳定、持久的高眼压状态。
2.睫状体平坦部滤过术可有效降低慢性实验性兔高眼压,该手术无明显并发症,对兔眼组织结构无明显损害。术后远期也会出现滤过泡增殖粘连。临床可作为治疗难治性青光眼有效、安全、简便手术方法之一,值得广泛推广。
3.巨噬细胞移动抑制因子、酰基辅酶A结合蛋白、鸟苷酸结合蛋白、线粒体ATP合酶可能参与了青光眼损伤修复、免疫调控、细胞信号转导、抗氧化应激等过程。