论文部分内容阅读
背景胆汁酸的分泌和胆汁形成是维持哺乳动物肝脏正常功能所必需。胆汁淤积是多种原因所导致的胆汁分泌或排泄障碍,其中进行性家族性肝内胆汁淤积(Progressive familial intrahepatic cholestasis,PFIC)是一种以自发性胆汁淤积为特征的常染色体隐性遗传病。ATP8B1,属于P4型ATP酶,其突变导致进行性家族性肝内胆汁淤积类型1(PFIC1)。PFIC1病人一般婴儿期发病,很快发展为肝纤维化和肝硬化,最终导致肝衰竭和肝癌等。根据病情的不同,病人通常在婴儿到青少年期间死于终末期肝病。ATP8B1突变小鼠血清胆汁酸稍微升高,离乳体重稍微降低,整体症状较轻,与临床病人大有不同。TMEM30A为P4型ATP酶的必不可少的β亚基,也是ATP8B1活性所必须,但TMEM30A在肝脏内的具体作用仍然不清楚。目的目前已有研究证实TMEM30A在体外能辅助P4型ATP酶活性,帮助P4型ATP酶转运到细胞膜,另外TMEM30A也能促进细胞迁移和肿瘤药物的摄取。但TMEM30A在体内的研究报道很少,我们希望通过Tmem30a肝脏特异性性敲除(liver-specificknockout,LKO)小鼠,研究TMEM30A在肝脏内的功能以及其作用机制。方法Tmem30aflox/flox小鼠与albumin-promoter Cre(Alb-Cre)转基因小鼠交配生出的Tmem30aflox/flox AlbCre+小鼠为Tmem30a肝脏特异性敲除小鼠(Tmem30a LKO小鼠)。用日立7180生化分析仪检测不同月龄小鼠血清生化指标;用苏木精和伊红(H&E)染色,Masson blue染色和免疫组化方法检测小鼠肝脏病理情况;用UPLC-MS/MS方法(Waters Acquity UPLC System and AB Sciex TripleQuad 5500)分析血清、胆汁、肝脏和粪便中胆汁酸的各种组成成分;用实时荧光定量PCR(Real Time quantitative PCR)检测肝脏胆汁酸转运蛋白和相关调控核受体的mRNA水平表达;用蛋白免疫印迹(WesternBlotting)检测肝脏特异性胆汁酸转运蛋白和相关调控核受体的表达;用免疫荧光检测胆汁酸转运蛋白及ATP8B1,ATP11C等蛋白的膜定位;用蛋白酶体抑制剂Bortezomib抑制蛋白酶体降解来挽救小鼠的表型;用胆汁酸补充饮食加重胆汁淤积表型。结果本研究首次证实Tmem30aLKO小鼠有明显的高胆汁酸和高胆红素血症,肝脏病理显示Tmem30aLKO小鼠有淋巴细胞和巨噬细胞浸润,胆管扩张和肝纤维化等。血清生化分析数据显示在2月龄时Tmem30a LKO小鼠血清总胆汁酸和总胆红素明显高于WT小鼠,且总胆红素中主要为直接胆红素。在不同月龄Tmem30a LKO小鼠中血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶和肝胆酸的活性明显高于WT小鼠。蛋白质印记和免疫荧光分析显示在Tmem30aLKO小鼠的肝脏中ATP8B1和ATP11C的蛋白表达和细胞膜定位明显降低,同时一些胆汁酸转运蛋白如有机阴离子转运蛋白OATP1A4和OATP1B2、牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)、毛细胆管胆汁酸盐输出泵(BSEP)和多药耐药相关蛋白-2(MRP2)等的蛋白表达和细胞膜定位也明显降低。此外,mRNA结果显示在Tmem30a LKO小鼠中胆汁酸转运蛋白Oatp1b2,Ntcp和Bsep明显降低。有意思的是,相关核受体如法尼醇X活化受体α(FXRα)、维甲酸X受体a(RXRα)、肝细胞核因子4α(HNF4α),肝脏同源受体-1(LRH-1),短异二聚体伴侣蛋白(SHP)等mRNA和蛋白表达水平在Tmem30aLKO小鼠中也明显降低。蛋白酶体抑制剂bortezomib能部分恢复ATP8B1、ATP11C、胆汁酸转运蛋白和相关核受体的蛋白水平,但是ATP8B1、ATP11C、胆汁酸转运蛋白在细胞膜上的定位并未改善。免疫荧光结果显示这些蛋白和二硫键异构酶(PDI)共定位于内质网,并在内质网里累积。胆汁酸饲料喂食能进一步加重雄性Tmem30a LKO小鼠的表型并造成非常严重的肝损伤,并导致过半雄性Tmem30aLKO小鼠死亡。另外,随着小鼠年龄的增加,Tmem30aLKO小鼠病情加重,有明显的炎症和肝纤维化等症状,并在14月龄以后雌雄小鼠都出现肝脏肿瘤。结论Tmem30a肝脏特异性敲除通过降低ATP8B1,ATP11C和胆汁酸转运蛋白的表达和膜定位,以及降低相关核受体的表达,导致肝内胆汁淤积,并进一步恶化为肝癌。因此,TMEM30A可能是肝内胆汁淤积新的致病机理之一,并与肝癌的发生发展有关。