病毒性疾病对人类的危害日趋严重，原有病毒病的死灰复燃及新增病毒病的不断出现，为世界医学界带来极大的挑战。虽然疫苗在以往控制病毒性疾病中发挥了极大的作用，但由于多种原因使得疫苗的研制受到极大的限制。而现有的抗病毒化疗药物不仅疗效不确切，达不到广谱高效的效果，易产生抗药性，而且在杀灭病毒的同时严重干扰正常细胞代谢而显示出明显的毒副作用，同样临床应用受限，发展缓慢。因此寻找安全、有效的抗病毒手段迫在眉睫。中药治疗病毒性疾病有几千年的历史，具有高效、广谱、低毒和疗效相对稳定等优点，且中草药自然资源丰富、品种繁多。但中药抗病毒的机理仍未被真正认识，因而限制了其开发应用。随着现代生物学技术的发展和新的模型在大规模抗病毒药物筛选中的应用，为抗病毒药物的开发提供了广阔的前景，因而也为从中药中寻找有效的抗病毒成分及揭示其机理提供了极好的条件。本课题在原有研究工作的基础上，筛选出具有明显抗HSV活性的栀子提取物T9、TH，并探讨其抗单纯疱疹病毒的作用靶点；为揭示中药的抗病毒机理、开发针对性治疗HSV并具有自主知识产权的现代中药奠定坚实的基础。一、栀子提取物T9、TH对单纯疱疹病毒1型VP16的影响VP16是HSV-1的结构蛋白，在病毒复制晚期参与病毒颗粒的组装，同时又作为重要的功能蛋白在病毒感染早期发挥重要的转录调节功能。VP16基因的表达已经被看作是单纯疱疹病毒复制发生的标志之一。正是由于VP16在HSV-1感染中的重要作用，本实验采用对疱疹病毒易感的BALB／C小鼠，以HSV-VP16为研究对象，用RT-PCR方法，半定量比较不同组别间HSV-VP16 mRNA水平，VP16 mRNA的相对表达量以“VP16光密度值／β-actin光密度值”表示，探讨栀子提取物T9、TH抗单纯疱疹病毒1型的作用机理。结果显示：病毒对照组在感染后第4天即可检出VP16 mRNA的表达，且随时间呈上升趋势，在感染后第10天达高峰，以后逐渐下降。T9、TH两个剂量采用口服和腹腔注射2种途径给药后均可明显降低小鼠脑内VP16 mRNA的表达，其总体趋势表现为：2种给药途径均为大剂量组优于小剂量组；口服给药明显优于腹腔注射给药；T9优于TH。说明栀子提取物T9、TH能够使单纯疱疹病毒感染小鼠脑内VP16 mRNA相对表达量降低，可能是它们抗单纯疱疹病毒的作用机理之一。目前国内外未见作用于这一靶点药物的报道。二、栀子提取物T9、TH对感染HSV-1小鼠脑内IFN-γ的影响IFN-γ是清除HSV的一种必要的免疫因子。被病毒感染后，激活的T细胞和NK细胞产生大量IFN-γ，IFN-γ刺激病毒感染的细胞表达MHCⅠ类分子，促进CTL杀伤病毒感染细胞，同时也增强NK细胞的杀伤病毒感染细胞活性。IFN-γ无论在天然免疫和获得性免疫中均发挥重要作用。本实验采用RT-PCR技术，观察不同组别之间HSV-1感染的BALB／C小鼠脑内IFN-γ随时间的变化情况，旨在探讨栀子提取物T9、TH抗单纯疱疹病毒1型在免疫方面的作用机理。结果显示：病毒对照组在感染后第4天即可明显检测出IFN-γmRNA的表达，且在感染后第4天至第10天内呈现平稳的表达；10天后IFN-γmRNA相对表达量开始下降；第14天后和感染初期相比呈现相对平稳的低水平表达。T9、TH两个剂量采用口服和腹腔注射2种途径给药后均可明显上调小鼠脑内IFN-γmRNA的表达，栀子提取物T9各给药组中除T9口服小剂量组外，其余各组在感染后7天达高峰，并且在感染后21天内仍然平稳表达；T9口服小剂量组在感染后14天达高峰，且表达量高于其余给药组。栀子提取物TH各给药组中，口服给药组均在第10天达高峰，注射给药组均在第14天达高峰。说明栀子提取物T9、TH能够通过某种机制上调单纯疱疹病毒感染小鼠脑内IFN-γmRNA相对表达量，可能是它们抗单纯疱疹病毒的又一作用机理。三、栀子提取物T9、TH对单纯疱疹病毒1型膜受体运动的影响利用单个微粒运动观察的方法对病毒感染及给药前后膜表面受体运动的研究可以对膜的结构功能及药物的作用靶点做出更深刻的解释。本实验采用容易培养的HEP-2细胞，研究单纯疱疹病毒1型及不同加药方式感染细胞的运动状态，并试图以此揭示细胞膜的一些性质及药物的作用机理。配体为F-HSV复合体，被标记的HSV与细胞膜表面HSV受体结合，使用荧光显微镜观测，用一个相增强的cCCD实时记录。并开发了一套细胞显微观测系统软件——单个微粒运动观察技术SPT(single particle tracking)技术，对实时图像进行单粒子追踪、轨迹分析和数据分析。同时用Aquacomos软件对同一时间不同组别图像的荧光强度进行处理，计算各组的吸附率及抑制率。结果显示：由于所选用的荧光探针FITC淬灭快，因此跟踪受体运动的时间短，病毒对照组受体运动的位移不大，其余加药组用该软件检测不到受体的运动。目前我课题组仍在继续寻找适合观察单纯疱疹病毒1型受体运动的荧光探针，其应不仅具有易与病毒结合的特性，同时又能减小自淬灭以保证扫描的时间。相关的试验还在进行中。对各组图像荧光强度的处理显示，栀子提取物T9、TH不同加药方式均能阻止HSV-1对HEP-2细胞表面的吸附，使病毒吸附量减少。说明栀子提取物T9、TH可能占据受体结合位点，也可能封闭或改变受体，或竞争配体吸附蛋白，而抑制病毒对细胞的吸附与侵染。我们在前期工作中证明栀子提取物T9、TH具有显著抗单纯疱疹病毒的活性。本实验研究发现其作用靶点可能是HSV-1的VP16，并阐明它们是通过抑制VP16的表达、提高IFN-γ的表达和抑制HSV-1对细胞膜的吸附而发挥抗病毒作用的。