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目的:结肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,趋化因子受体也在各种肿瘤的发生和转移中有重要作用。趋化因子受体7(Chemokine receptor 7,CXCR7)是7次跨膜G蛋白耦联受体超家族,具有趋化因子受体的典型结构,在许多肿瘤中均有表达。既往有证据表明CXCR7促进结肠癌的血管生成,但这一过程中涉及的机制尚不清楚。本研究的目的在于研究CXCR7在结肠癌中的功能。本研究通过体内和体外同时验证,并运用超声造影(Contrast-enhanced ultrasound,CEUS)技术探讨在小鼠结肠癌异种移植瘤中过表达或沉默CXCR7后灌注参数与微血管密度(microvessel density,MVD)之间的相关性。研究方法:本研究以正常结肠细胞(HCoEpic)和结肠癌RKO、HCT116、SW480、Caco-2细胞系为研究对象。首先,通过qRT-PCR和Western Blot法检测正常结肠细胞和结肠癌细胞中CXCR7的表达。其次,对筛选出的两种CXCR7表达最高和表达最低的细胞系进行沉默或过表达并通过qRT-PCR和Western Blot法检测其转染效率。再者,通过CCK-8、EdU、Transwell法检测转染后的结肠癌细胞的增殖和迁移能力。此外,将转染成功的细胞与脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)共培养,通过CCK-8、EdU、Transwell、管腔形成实验检测转染后的细胞对HUVEC细胞的增殖、迁移、血管形成的影响。收集转染后的细胞及其上清液检测细胞和上清液中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。同时对转染后的细胞加入抑制剂LY294002和U0126后进行AKT和ERK通路的检测,最后,将稳定转染的细胞接种于裸鼠皮下形成移植瘤后进行超声造影检测,并进行免疫组化和Western blot分析各因子及其通路的表达。结果:1、采用qRT-PCR和Western Blot法检测正常结肠细胞和结肠癌细胞中CXCR7的表达。结果表明,与正常结肠细胞相比,CXCR7在四种结肠癌细胞中均呈现高表达,其中SW480细胞表达最高,Caco-2细胞表达最低。2、将SW480细胞进行沉默并将Caco-2细胞进行过表达,qRT-PCR和Western Blot结果显示沉默CXCR7的SW480细胞表达成功降低,过表达CXCR7的Caco-2细胞表达成功增加,差异有统计学意义(P<0.05)。3、通过CCK-8、EdU和Transwell实验检测转染后的SW480和Caco-2细胞增殖和迁移能力,其结果显示,与阴性对照组相比,沉默CXCR7的SW480细胞的增殖和迁移能力均降低;相反,过表达CXCR7的Caco-2细胞的增殖和迁移能力均增加。其次,将转染后的细胞与HUVEC细胞共培养,通过CCK-8、EdU和Transwell实验检测HUVEC的增殖和迁移能力,与阴性对照组相比,与沉默CXCR7的SW480细胞共培养的HUVEC的增殖和迁移能力显著降低;相反,与过表达CXCR7的Caco-2细胞共培养的HUVEC的增殖和迁移能力显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。血管生成实验结果显示,与阴性对照组相比,与沉默CXCR7的SW480细胞共培养的HUVEC的血管连接点的数量显著降低,与过表达CXCR7的Caco-2细胞共培养的HUVEC的血管连接点的数量显著增加,同时,进一步的研究发现抑制剂LY294002和U0126可以下调过表达后细胞的增殖,迁移和管腔形成能力。4、ELISA检测了转染后细胞中上清液的VEGF浓度。结果显示,与阴性对照组相比,与沉默CXCR7的SW480细胞共培养的HUVEC的VEGF的水平显著降低,与过表达CXCR7的Caco-2细胞共培养的HUVEC的VEGF的水平显著增加。同时,进一步研究发现抑制剂可以下调过表达后细胞的VEGF浓度。差异有统计学意义(P<0.05)。5、转染成功后的细胞进行AKT和ERK通路的检测,Western Blot结果显示,与阴性对照组相比,沉默CXCR7的SW480细胞降低了AKT和ERK的磷酸化以及VEGF表达,过表达CXCR7的Caco-2细胞增加了AKT和ERK的磷酸化以及VEGF表达,并且AKT和ERK信号传导可以在结肠癌细胞中相互调节。qRT-PCR结果显示,与阴性对照组相比,沉默CXCR7的SW480细胞降低了VEGF表达,过表达CXCR7的Caco-2细胞增加了VEGF表达,同时,进一步研究发现抑制剂可以下调过表达后细胞的VEGF表达。6、将RKO、HCT116、SW480、Caco-2四种结肠癌接种于裸鼠皮下,结果显示SW480细胞产生的肿瘤较大且体积增加较快,Caco-2细胞产生的肿瘤较小且体积增加较慢。结肠癌肿瘤组织中超声造影参数的比较结果显示SW480和Caco-2肿瘤的曲线下面积(AUC)和峰值强度(PI)有明显差异,SW480肿瘤的PI(162.5±7.5)和AUC(1278.6±40.4)值最高,Caco-2肿瘤的PI(5.5±1.3)和AUC(96.2±14.7)值最低。7、将沉默CXCR7的SW480细胞和过表达CXCR7的Caco-2细胞接种于裸鼠皮下形成移植瘤,检测CXCR7沉默或过表达后肿瘤的生长情况和超声造影后参数的差异,结果显示,与阴性对照组相比,沉默CXCR7的SW480细胞的肿瘤组织大小与体积均明显减小,超声造影参数PI和AUC也明显下降,且结果有统计学意义。相反,过表达CXCR7的Caco-2细胞的肿瘤组织大小与体积均明显增加,超声造影参数PI和AUC也明显升高,结果有统计学意义。8、免疫组织化学染色结果显示:沉默CXCR7的SW480细胞的肿瘤组织中CXCR7、VEGF、Ki67和p-ERK因子的肿瘤组织染色均较阴性对照组明显降低,染色评分结果有统计学意义。过表达CXCR7的Caco-2细胞的肿瘤组织中CXCR7、VEGF、Ki67和p-ERK因子的肿瘤组织染色均较阴性对照组明显增加,染色评分结果有统计学意义。9、通过CD34免疫组织化学染色检测肿瘤微血管密度(MVD),结果显示:与阴性对照组相比,沉默CXCR7的SW480细胞的肿瘤组织中的微血管显著减少,过表达CXCR7的Caco-2细胞的肿瘤组织中的微血管显著增加。我们将MVD与超声造影参数的相关性进行了比较,结果显示峰值强度(PI)和曲线下面积(AUC)与过表达或沉默的结肠癌组织中的MVD相关性较高,其他参数与MVD值之间无显著相关性。10、最后,我们通过Western Blot检测肿瘤组织中CXCR7、VEGF、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK因子的表达,结果表明:过表达CXCR7的Caco-2细胞的肿瘤组织中的p-AKT、p-ERK、CXCR7和VEGF因子表达均比阴性对照组增加,沉默CXCR7的SW480细胞的肿瘤组织中的p-AKT、p-ERK、CXCR7和VEGF因子表达均比阴性对照组减少,且有统计学意义。结论:综上所述,1、CXCR7的表达可以通过激活AKT和ERK途径促进结肠癌的生长和血管生成。CXCR7对结肠癌的潜在治疗提供了靶标。2、在沉默或过表达CXCR7的结肠癌肿瘤中超声造影参数之间有显著差异,因此PI和AUC可用作CEUS中可靠的指标来评估肿瘤灌注。使用CEUS量化肿瘤灌注对检测肿瘤血管生成有一定的价值。