论文部分内容阅读
基因芯片是一种通量高、特异性强的基因水平的检测平台,被广泛应用于杂交测序、基因差异性表达、SNP位点检测、药物筛选、疾病诊断等。基因芯片的灵敏度受到多种因素的影响,要达到提高管盖芯片灵敏度的要求,必须对管盖芯片的整个检测体系进行优化。本课题是旨在提高人乳头瘤病毒分型和转基因大豆在管盖芯片上检测的灵敏度,使其灵敏度达到100copies/μl。本文的研究内容如下:(1)检测平台的优化,扩增检测一体化的体系的构建。为了建立扩增检测一体化的体系,首先针对整个实验中影响杂交效果三个主要步骤进行了优化处理,其包括PCR扩增体系、杂交反应、芯片制备,并且针对HPV扩增的通用引物对不同HPV分型模板的扩增效率不一的情况,增加了几对具有特异扩增效率较高的引物对。关于PCR扩增体系的优化有引物的设计、不对称PCR扩增的探究。优化引物设计是为筛选出扩增特异性最好的PCR扩增产物,提高特异性杂交的的效率;不对称PCR扩增的探究是为了获得较多带荧光标记单链靶序列,即增加了杂交反应的待测样品的量,为杂交反应做了好铺垫。为了杂交反应拥有较好的杂交效果,对杂交的时间、杂交基底、质控探针浓度进行了优化处理,同时为了确保芯片的质量,在芯片上增加了位置质控、杂交质控等。(2)以管盖芯片为检测平台,对转基因大豆进行检测。在100个copies/μl下能够成功的扩增转基因大豆的MON89788基因、GTS-40-3-2基因、A2704-12基因、A5547-127基因及内标Lectin基因。实验使用该平台,对其进行基因检测,在100个copies/μl下能够检测到这个四个基因。转基因大豆的杂交信号的信噪比值都达到了预期标准要求。(3)以管盖芯片为检测平台,对HPV进行分型检测。本论文通过使用该平台能够在100 copies/μl下,能成功的进行PCR扩增有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、26、53、66、6、11、40、42、43、44、61、70、72、81、83,并能通过杂交进行HPV分型检测。对HPV16、18、31、33、35、39、40、45、44、61、70、72、81杂交信号进行性噪比评价分析,HPV的性噪比值都在都大约等于1.5,除了HPV45的性噪比较低,HPV的杂交信号的SNR值达到了预期的信噪比要求。