奇异变形杆菌（Proteus mirabilis,PM）是一种人畜共患的条件性致病菌,广泛分布于自然界中,可引起消化道、呼吸道、泌尿生殖道的感染,给人类健康和畜牧养殖业带来了巨大的威胁。外膜囊泡（outer membrane vesicles,OMV）是由革兰氏阴性细菌在生长过程中分泌的具有磷脂双分子层结构的球状小泡,携带有外膜蛋白、脂多糖、核酸以及毒力因子等物质,是细菌与外界环境交流的重要工具。研究表明,外膜囊泡在致病菌的感染过程中起着重要作用,它通过介导毒力因子的转运过程,提高病原微生物的致病力和侵袭力,从而影响宿主细胞的生理过程。本试验从奇异变形杆菌中分离纯化外膜囊泡,在此基础上,通过体外感染试验,探究了奇异变形杆菌外膜囊泡对猪小肠上皮细胞活性的影响作用,为进一步研究奇异变形杆菌的致病机制和防治奇异变形杆菌引起的肠道疾病提供新的思路。主要研究内容如下:1.奇异变形杆菌的分离鉴定本试验从重庆市荣昌区规模化养猪场采集腹泻仔猪粪便样本122份,并从中分离培养出细菌。经过细菌的培养特性、革兰氏染色镜检、16S r RNA扩增测序等试验成功分离并鉴定出22株奇异变形杆菌。随机选择5株制备菌悬液并对小鼠腹腔注射进行攻毒试验,攻毒24h后解剖发现小鼠肠粘膜出血严重,肠道充斥大量黄色透明的内容物,表明奇异变形杆菌对肠道具有极强的侵袭力和致病力。同时测定了奇异变形杆菌临床分离株的生长曲线,37℃、180rpm振荡培养至16h即进入生长稳定期。该时期细菌总数最大,外膜囊泡分泌量最多,是提取外膜囊泡的最佳时间点。2.奇异变形杆菌外膜囊泡的分离提取奇异变形杆菌培养至16h后,采用超滤离心法和密度梯度离心法分离提取纯化外膜囊泡,运用透射电镜观察其外观形态,纳米颗粒跟踪分析仪测定密度和粒径,BCA蛋白定量分析试剂盒测定蛋白浓度,SDS-PAGE试验分析其蛋白组分。结果表明,奇异变形杆菌外膜囊泡呈大小不等的无色透明状球形小泡,粒径在80-220nm之间,其中139nm的最多;密度为3.85×10~9个/ml,蛋白浓度约为158.62 ug/ml;蛋白组分在85-10 KDa之间,主要集中在85、50、10KDa左右。3.奇异变形杆菌外膜囊泡对猪小肠上皮细胞IEPC-J2活性的影响根据BCA法测定的蛋白浓度,将外膜囊泡倍比稀释成一定浓度梯度（79.31、39.66、19.83、9.91、4.96ug/ml）后添加到体外培养的猪小肠上皮细胞IEPC-J2中进行攻毒试验。MTT法测定细胞的存活率,结果显示,与对照组相比,添加了外膜囊泡的细胞存活率显著降低（P<0.05）,且随着添加浓度升高,细胞存活率降低,表明外膜囊泡对猪小肠上皮细胞活性存在一定的抑制作用。为进一步研究奇异变形杆菌外膜囊泡对猪小肠上皮细胞活性的影响,外膜囊泡攻毒猪小肠上皮细胞后,通过测定细胞上清液中IL-8含量、DCFH-DA荧光探针测定细胞活性氧水平、单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤程度。试验结果显示:与对照组相比,添加了外膜囊泡后,细胞上清液的IL-8含量显著性升高（P<0.05）,且外膜囊泡浓度达到39.66ug/ml攻毒4d时,分泌IL-8水平达到峰值;同时,细胞活性氧水平显著性上升（P<0.05）;根据测定的细胞尾部DNA含量百分比（Tail DNA%）结果显示,添加了外膜囊泡后细胞的Tail DNA%显著性升高（P<0.05）,最低浓度组4.96ug/ml在攻毒2d后可引起细胞DNA损伤,其他浓度的外膜囊泡在所有攻毒时间内均可引起明显的细胞DNA损伤。这表明奇异变形杆菌外膜囊泡可刺激猪小肠上皮细胞IEPC-J2分泌细胞因子IL-8,诱导细胞产生炎症反应;刺激细胞产生更多的活性氧,增加细胞的氧化压力,从而对细胞造成氧化损伤;诱导细胞DNA双键断裂损伤,且呈一定程度的浓度、时间依赖性。综上所述,奇异变形杆菌外膜囊泡对猪小肠上皮细胞的活性存在一定的抑制作用,导致细胞存活率降低,刺激细胞产生炎性反应,引起细胞氧化损伤,以及诱导细胞DNA双链损伤。