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研究背景和目的治疗性血管生成(theraputic angiogenesis)是指引入外源性的生长因子(蛋白或基因),促进血管的生成,以改善组织的血液供应,它为治疗冠心病引起的心肌缺血提供了新的思路。在众多的信号分子中,与治疗性血管生成直接相关的主要有四跨膜超家族(transmembrane-4 superfamily, also called tetraspanins, TM4SF)等蛋白族群。TM4SF是细胞膜上蛋白质分子序列高度保守的一类蛋白族群,它也是整合素的关联蛋白。其中CD151是TM4SF最重要的成员之一。研究表明CD151能参与调节细胞形态、粘附、迁移、半桥粒结构形成等多种细胞功能,而且CD151还能与整合素相互作用介导血管生成。近几年,有关CD151促血管生成的研究表明CD151能维持细胞形态及体外血管形成；CD151转染脐静脉内皮细胞能使内皮细胞在基质上的增殖、迁移和管状结构形成能力明显增强；CD151转染大鼠缺血后肢能使肢体功能、微血管及侧支循环形成能力均明显提高；将CD151导入大鼠和小型猪心肌梗死模型中,能使缺血心肌局部血管密度明显增加,缩小心肌梗死面积,明显改善心功能。对CD151基因敲除的大鼠进行实验研究发现CD151基因敲除后大鼠的血管生成能力明显减弱。这一系列的实验结果均表明CD151能够促进血管生成可用于治疗缺血性心脏疾病。随着基因治疗研究的深入,人们越来越关注基因治疗的安全性和导入方式的重要性。如何将外源基因安全无创伤地导入靶组织,不仅能起到良好的治疗目的,同时还要减少被其它组织摄取后可能引起的副作用成为我们此次研究的重点。我们拟将CD151作为基因治疗运用于临床,不仅要能安全导入缺血心肌促进功能血管的形成,还要减少其被体内其它组织吸收,以避免可能的副作用。由此,我们仍选择腺相关病毒载体携带CD151基因,尝试对该载体的启动子区进行改建,使CD151基因真正做到安全、高效、靶向治疗心肌缺血疾病。研究方法1.构建质粒pAAV-HRE-CD151、pAAV-MLC-CD151及pAAV-HRE-MLC-CD151,质粒扩增、提取。2.生长良好的H9C2细胞传至6孔板,待细胞生长至60-70%左右汇合后,各孔细胞分别转染质粒pAAV-GFP、pAAV-CD151及pAAV-HRE-CD151,同时细胞设置空白对照组,不转染质粒,只加等体积的PBS。48小时后,将细胞分成两组(每组均含有以上各质粒分别转染的细胞),一组置于含氧量正常条件下(95%空气,5%CO2)无血清DMEM培养基中培养16小时,另一组置于缺氧条件下(95%N2,5%CO2)无血清DMEM培养基中培养16小时。然后收获细胞,提取蛋白,Western blot检测CD151蛋白在各组细胞中的表达。3.将成功进行了心肌缺血模型造模后的成年SD雄性大鼠18只随机分成3组,即对照组(手术成功1天后,舌下静脉注射1ml生理盐水)、pAAV-CD151组(手术成功1天后,舌下静脉注射1ml含200μg pAAV-CD151质粒的生理盐水)、pAAV-MLC-CD151组(手术成功1天后,舌下静脉注射1ml含200μg pAAV-MLC-CD151质粒的生理盐水),每组6只(n=6)。质粒注射4周后处死大鼠取出心脏、肝脏和肾脏组织。Western blot检测CD151蛋白在缺血心脏、肝脏和肾脏组织中的表达,免疫组化检测缺血心肌的微血管密度。4.将成功进行了心肌缺血模型造模后的成年SD雄性大鼠24只,随机分成4组,即对照组(手术成功1天后,舌下静脉注射1 ml生理盐水)、pAAV-CD151组(手术成功1天后,舌下静脉注射1 ml含200μg pAAV-CD151质粒的生理盐水)、pAAV-MLC-CD151组(手术成功1天后,舌下静脉注射1 ml含200μg pAAV-MLC-CD151质粒的生理盐水)及pAAV-HRE-MLC-CD151组(手术成功1天后,舌下静脉注射1 ml含200μgpAAV-HRE-MLC-CD151质粒的生理盐水),每组6只(n=6)。质粒注射4周后处死大鼠取出心脏。Western blot检测CD151蛋白在各组大鼠缺血心肌组织中的表达,Real-timePCR检测各组缺血心肌组织CD151 mRNA水平,免疫组化检测缺血心肌的微血管和小动脉密度。实验结果1.成功构建质粒pAAV-HRE-CD151、pAAV-MLC-CD151及pAAV-HRE-MLC-CD151,经测序鉴定表明构建正确。2.缺氧反应元件HRE调控CD151在缺氧心肌细胞的表达。用质粒pAAV-HRE-CD151、pAAV-CD151及pAAV-GFP分别转染H9C2细胞,Western blot检测各组细胞的CD151蛋白表达,结果发现在缺氧条件培养下,pAAV-HRE-CD151组CD151蛋白表达明显较空白对照组、pAAV-GFP组及pAAV-CD151组增加(P<0.01)；在含氧量正常条件培养下,pAAV-HRE-CD151组CD151蛋白表达与空白对照组、pAAV-GFP组相比有显著增加(P<0.01),而与pAAV-CD151组相比并无显著性差异(P>0.05)。3.心肌特异性启动子MLC诱导CD151在大鼠缺血心肌中的表达。成功建立大鼠心肌缺血模型后,将质粒PAAV-CD151、pAAV-MLC-CD151分别导入大鼠体内,4周后,Western blot检测心肌缺血部位的CD151蛋白表达,发现pAAV-MLC-CD151组的心肌缺血区域CD151蛋白表达与对照组和pAAV-CD151组相比明显增加,具有非常显著性差异(P<0.01)。同时,检测pAAV-MLC-CD151组CD151蛋白在大鼠肝脏和肾脏中的表达,分别与pAAV-CD151组大鼠肝脏和肾脏中的表达进行比较,发现CD151蛋白在pAAV-MLC-CD151组大鼠肝脏和肾脏中的表达明显减少,具有非常显著性差异(P<0.01)；但pAAV-MLC-CD151组与对照组相比,CD151蛋白在各自肝脏和肾脏中的表达两组之间无显著性差异(P>0.05)；免疫组化结果表明pAAV-MLC-CD151组大鼠缺血区域心肌与对照组和pAAV-CD151组相应部位比较,其微血管密度增加,差异有统计学意义(P<0.05)。4.缺氧反应元件HRE和心肌特异性启动子MLC同时调控CD151在大鼠缺血心肌中的表达。将质粒pAAV-CD151、pAAV-MLC-CD 151及pAAV-HRE-MLC-CD151分别导入大鼠心肌缺血模型,4周后,Western blot检测各组大鼠心肌缺血部位CD151蛋白表达,Real-time PCR检测大鼠心肌缺血部位的CD151 mRNA水平,发现pAAV-HRE-MLC-CD 151组的心肌缺血区域CD151蛋白表达及mRNA水平与对照组、pAAV-CD151组及pAAV-MLC-CD151相比明显增加,具有非常显著性差异(P<0.01)；缺血部位心肌微血管及小动脉计数结果显示：pAAV-HRE-MLC-CD151组比正常对照组、pAAV-CD151组及pAAV-MLC-CD151组相应部位生成较多的微血管和小动脉,差异有统计学意义(P<0.05)。实验结论1.缺氧反应元件HRE能增加CD151在缺氧心肌细胞的表达。2.心肌特异性启动子MLC能诱导CD151基因在心肌的特异性表达。3.腺相关病毒介导缺氧反应元件及心肌特异性启动子同时调控CD151能在缺血心肌高表达,提高基因治疗的转染效率,同时,高表达的CD151能促进缺血心肌微血管和小动脉的生成。