细胞基因修饰技术和体细胞核移植技术相结合成为生产转基因动物的一种有效方法。小型猪在体积、新陈代谢、器官组织结构和基因组等方面都与人的极为相似,是人类疾病模型的首选动物。转基因克隆猪的生产对农业、生物医学和基础研究都具有重要的应用价值,目前猪的克隆效率低,限制了其在多个领域的应用。因此,本研究是为建立高效稳定的转基因克隆猪的生产平台,并在此基础上优化转基因克隆猪生产的技术程序,以期提高转基因克隆猪的生产效率,为转基因克隆猪更广泛的应用奠定基础。本研究的试验方法和结果简述如下：1.巴马小型猪体细胞的分离培养本实验从出生3日的巴马小型猪成功分离出了巴马小型猪肾脏成纤维细胞、耳部成纤维细胞和睾丸成纤维细胞。对细胞类型进行免疫组化染色鉴定时,肾脏成纤维细胞、耳部成纤维细胞和睾丸成纤维细胞,抗波形蛋白均显阳性,抗角形蛋白显阴性。根据组织来源、细胞的形态及免疫组化结果表明：本实验成功分离出三种组织来源的成纤维细胞。2.转基因细胞系的建立及其生物学特性的研究转基因克隆胚胎生产中,建立高质量的转基因阳性细胞系是获得克隆动物的关键。本章试验结果如下：细胞转染hGFAP-DsRed基因后,经博莱霉素筛选获得了肾脏、睾丸和耳部细胞转基因克隆斑,PCR鉴定结果与目的片段大小一致,所获得的克隆斑为转基因体细胞。检测了转基因细胞是否被微生物(细菌、真菌、病毒)污染,三种转基因细胞的培养液均未见浑浊现象,结果表明,转基因肾脏、睾丸和耳朵成纤维细胞均未被细菌和真菌污染；用红细胞吸附实验检测转基因细胞系是否被病毒污染,结果未见细胞凝聚成团或者与体细胞吸附,表明3种不同组织来源的转基因成纤维细胞未被病毒污染；采用PCR和Hoechst33342染色检测支原体污染,结果为阴性；分析不同代次转基因细胞的核型,结果表明,随着代次的增大正常2倍体细胞的比率有降低的趋势,但差异不显著；对转基因细胞系进行了长期的传代培养,转基因肾脏成纤维细胞目前已传至56代,转基因耳部成纤维细胞传至30代,转基因睾丸成纤维细胞传至25代。总之,本试验成功建立了3种类型转基因细胞系,为后续的体细胞核移植实验提供了高质量,充足的转基因供体细胞。3.转基因克隆胚胎融合/激活条件的优化融合/激活是体细胞核移植重构胚胎构建关键的一步,只有经过融合、激活的胚胎才能开始重编程,启动基因表达,继续发育。本实验优化了转基因克隆胚胎融合/激活的参数,结果如下：脉冲时程30μs,1次脉冲,场强1.5kv/cm组,融合率(87.32%)和分裂率(69.79%)显著高于1.0KV/cm(78.63%,45.07%)和2.0kv/cm(63.87%,36.72%)。囊胚率显著高于1.0kv/cm和2.0kv/cm (21.74%vs.9.65%,5.49%,P<0.05);脉冲时程30μs时,融合率(81.92%)和囊胚率(19.56%)显著高于20μs(69.19%,7.51%)和40μs (69.28%,6.51%), (P<0.05);3次脉冲组的融合率(63.32%vs.81.92%,81.59%,P<0.05)、分裂率(38.09% vs.63.40%,67.46%,P<0.05)和囊胚率(5.49% vs.33.15%,12.97%,P<0.05)均显著低于1次脉冲和2次脉冲组；而在相同脉冲次数和脉冲时间下,转基因克隆胚胎需要的场强相对要大。总之,本实验室条件下,最适合于转基因克隆猪胚胎生产的融合/激活参数是1.5kv/cm、30μs和1次脉冲。4.供体细胞的细胞周期、细胞种类和细胞代次对转基因克隆胚发育的影响供体细胞所处的细胞周期,细胞种类和细胞代次对体细胞核移植胚胎的发育潜能有很大的影响,本实验检测了血清饥饿、Roscovitine和接触抑制法对转基因细胞同期化效果以及三个处理组细胞作为供体核对重构胚胎发育能力的影响；比较了不同类型的转基因供体细胞作为供体核对构建重构胚胎发育潜能的影响；采用第10、20、30代的转基因肾脏成纤维细胞作为供体核,研究细胞的代次对转基因克隆胚胎发育潜能的影响。研究结果如下：三种同期化方法均能将80%以上的细胞处于G0/G1期,接触抑制和roscovitine组显著高于血清饥饿组(92.11%,89.59% vs.80.82%,P<0.05)；相反,处于S期的细胞,血清饥饿组显著高于接触抑制组和roscovitine(14.99% vs.2.54%,6.34%,P<0.05)；处于G2/M期的细胞,三组之间差异不显著(P>0.05)；血清饥饿组、接触抑制组和roscovitine处理组,细胞凋亡率分别为(14.13%,6.71%,2.46%),血清饥饿组细胞凋亡率显著高于另外两组(P<0.05)。检测了三个处理组的细胞BAX, BCL-2的相对表达量,BAX的表达量以血清饥饿组最高,而血清饥饿组BCL-2表达量最低。结果表明：血清饥饿能够增加转基因细胞的凋亡率,roscovitine能够降低转基因细胞的凋亡率；以三种细胞为供体核所获得囊胚率,血清饥饿组显著低于roscovitine组和接触抑制组(14.2%vs.21.30%,20.3%,P<0.05)。转基因肾脏成纤维细胞、耳部成纤维细胞和睾丸成纤维作为供体核构建的克隆胚胎囊胚发育率差异不显著(18.08%,10.19%,10.76%,P>0.05)。结果表明：三种类型的转基因细胞均支持克隆胚胎的发育,以肾脏成纤维细胞为供体时囊胚率最高,肾脏成纤维细胞更适合于转基因克隆猪生产的核供体细胞。5. Oxamflatin对转基因克隆猪胚胎发育的影响体细胞核错误的表观遗传重编程是引起克隆低效率的主要原因,有研究表明,通过添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂,如oxamflatin能够提高体细胞核移植胚胎的发育潜能,本实验研究oxamflatin对猪转基因克隆胚胎发育的影响。结果如下：用1μM 的 oxamflatin处理克隆胚胎12h,与对照组相比能够显著提高转基因克隆猪的发育能力(29.63%vs.17.53%, p<0.05), oxamflatin能够改变AcH4K8的表观遗传状态,提高了转基因克隆胚胎2-cell,囊胚期胚胎的组蛋白乙酰化水平,使AcH4K8组蛋白乙酰化水平更接近与体外受精(IVF)胚胎,显著提高了转基因克隆猪胚胎的体外发育能力,oxamflatin能够提高与胚胎发育相关多能基因(Oct-4, Sox-2, Nanog)和抗凋亡基因(BCL-2)的相对表达量,降低促凋亡基因(BAX)的表达。总之,组蛋白乙酰化酶抑制剂oxamflatin能够改变转基因克隆胚胎的表观遗传状态和基因表达,增加囊胚率,提高核的重编程能力和胚胎的发育潜能。6.利用本研究建立的体系进行胚胎移植,胚胎移植后获得3头克隆猪,经PCR扩增、制作冰冻切片在荧光显微镜下观察和Western Blotting等方法进行初步鉴定,其中一头被鉴定为转hGFAP-DsRed基因阳性克隆猪。