基于iTRAQ技术研究浮萍(Lemna minor)对铝(Al)胁迫的响应机制

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本文以分布广泛的高等水生植物浮萍(Lemna minor)为研究材料,以植物非必须金属元素铝(A1)为胁迫因子,运用生理生化、iTRAQ技术、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WesternBlot)等技术,系统的研究了浮萍对Al胁迫的响应机制。1.用含不同浓度A1(0,100,300,500μM)的1/10Hoagland营养液处理浮萍15 d后,主要分析了 Al在浮萍体内的积累及其对叶片损伤、生长、活性氧(ROS)产生、酶促和非酶促保护系统、同工酶表达和渗透调节物质等的影响。研究结果表明:(1)随着处理浓度的增加,Al在浮萍中的积累量明显上升。同时,叶片出现失绿症状,光合色素和可溶性蛋白含量都明显减少,其中,最高Al浓度的光合色素和蛋白含量分别为对照组的72%(Chla)、67%(Chlb)、84%(Car)和37%。而可溶性糖含量则表现为先增加后减少,并在300μM浓度时达到最大值,为对照的2.4倍。(2)活性氧组化分析结果表明,过氧化氢(H202)和超氧阴离子(O2·-)积累明显增加。同时,抗氧化酶系统的平衡被打破,超氧化物歧化酶(SOD)逐渐降低,过氧化氢酶(CAT)活性先升高后下降。其中,与对照组相比,最高Al处理浓度使SOD活性下降了 33%,CAT活性减少了 44%。与SOD和CAT变化不同,过氧化物酶(POD)活性逐渐升高,最高浓度时达到对照水平的1.5倍。同工酶电泳分析发现,SOD、POD和CAT谱带数目没有明显变化,只是影响了SOD、POD和CAT表达量,分别导致SOD和CAT表达量下降和POD上升。(3)随Al处理浓度的上升,AsA-GSH循环系统的关键酶抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性以及抗坏血酸(AsA)含量先降后升,最高A1处理浓度时APX和GR水平分别达到对照的1.7倍和1.3倍,AsA则始终低于对照水平。而脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性呈递减趋势,最高处理浓度的酶活性仅为对照的78%。与上述不同,脱氢抗坏血酸(DHA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量随Al处理浓度增加而逐渐上升,其中前者在最高A1处理组的含量比对照高1.5倍。而氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量则先增加后减少。(4)非蛋白巯基(NP-SH)和植物络合素(PCs)含量表现为先升后降,并在300 μMAl浓度时达到峰值,分别为对照的1.5倍和3.4倍。在最大A1处理组,NP-SH和PCs含量虽然稍微下降,但仍高于对照组。2.用含300 μ浓度Al的1/10 Hoagland营养液处理浮萍15 d后,利用iTRAQ技术从蛋白质水平研究了浮萍对Al胁迫响应的分子机制。分析结果表明:与对照相比,A1处理组共检测出261个差异表达蛋白,其中包含162个下调蛋白和99个上调蛋白。接着我们对这些差异蛋白进行了 COG功能分类和KEGG通路富集分析。COG功能分类主要将差异蛋白分为信息存储和处理相关蛋白、细胞过程和信号相关蛋白、代谢相关蛋白以及功能未知蛋白。KEGG通路富集分析进一步证明浮萍的代谢过程受Al胁迫影响最大。其中,与能量代谢相关的光合作用蛋白表达水平显著下降,说明浮萍的光合系统受到了金属A1严重的破坏。我们运用qRT-PCR和Western Blot技术进一步验证了 iTRAQ检测到的某些光合作用相关参数的基因和蛋白表达情况,结果与iTRAQ的蛋白表达趋势一致,这证明了蛋白质组学数据的可重复和可靠性。抗氧化酶蛋白、碳水化合物代谢中的有机酸合成蛋白和氨基酸代谢相关蛋白的上调表达可能在浮萍对A1毒适应方面发挥着至关重要的作用。
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