【摘 要】
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细胞标记与追踪是研究胰腺发育与再生的一种重要手段。传统的Cre-loxP细胞标记系统需要两个质粒,其中一个用于组织特异性表达重组酶Cre,另一个用于组成型表达报告基因,但该系
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细胞标记与追踪是研究胰腺发育与再生的一种重要手段。传统的Cre-loxP细胞标记系统需要两个质粒,其中一个用于组织特异性表达重组酶Cre,另一个用于组成型表达报告基因,但该系统目前只能用于单一种类细胞的标记。为进一步改善细胞标记技术,实现对胰岛素阳性、阴性细胞的双标记,本研究设计了一种新的单载体系统,该载体利用大鼠胰岛素启动子(RIP)控制重组酶Cre的表达,利用组成型CMV强启动子控制另一个重组酶Flp、内部核糖体进入位点(IRES)、红色荧光蛋白基因(DsRed)、及绿色荧光蛋白基因(EGFP)的表达。同时,在重组酶Cre及Flp的编码区内部各插入一个内含子,以消除质粒制备过程中外源基因的非特异性表达,从而使胰岛素阳性、阴性细胞分别被标记为绿色和红色。在该载体的构建过程中我们发现,由于Cre酶的放大作用,RIP的组织特异性显著降低。为提高RIP的组织特异性,本研究探讨了加快Cre在细胞内的分解速度,降低Cre在细胞中的表达量,或减弱Cre的酶活性等途径。研究结果表明,Cre基因173位精氨酸突变为组氨酸后,导致RIP控制的Cre(R173H)在小鼠beta细胞NIT-1中保持高效重组,但在人胚肾293细胞中重组为零。此载体将为研究胰腺发育和再生过程中胰岛素阳性与阴性细胞的各自变化与相互转化提供有力的分子生物学工具。
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