【摘 要】
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目的:研究miR-146b-5p在胆囊癌中的表达及对胆囊癌细胞生物学行为的影响,并初步揭示可能的作用机制。方法:首先,利用RT-qPCR技术检测胆囊癌组织及细胞株中miR-146b-5p的表达。其次,在胆囊癌细胞中转染miR-146b-5p模拟物（mimic）和抑制物（inhibitor）。采用CCK-8、EdU染色和克隆形成实验检测miR-146b-5p对细胞增殖活性的影响;流式细胞术和TUNE
【基金项目】
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十三五南京市卫生青年人才基金（合同号:QRX17105）；
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目的:研究miR-146b-5p在胆囊癌中的表达及对胆囊癌细胞生物学行为的影响,并初步揭示可能的作用机制。方法:首先,利用RT-qPCR技术检测胆囊癌组织及细胞株中miR-146b-5p的表达。其次,在胆囊癌细胞中转染miR-146b-5p模拟物（mimic）和抑制物（inhibitor）。采用CCK-8、EdU染色和克隆形成实验检测miR-146b-5p对细胞增殖活性的影响;流式细胞术和TUNEL检测观察细胞凋亡率;划痕实验和Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力;Western blot检测细胞中增殖相关蛋白 PCNA,凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2,及迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT）相关蛋白COX-2、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 表达。双荧光素酶报告验证 miR-146b-5p 与TLR4 3’-UTR的结合情况,并分析miR-146b-5p与TLR4的相关性;用RT-qPCR、Western blot检测胆囊癌组织及细胞株中TLR4 mRNA和蛋白表达,并检测miR-146b-5p对TLR4表达的调控作用。构建TLR4过表达质粒,通过回复实验验证miR-146b-5p是否通过靶向TLR4参与胆囊癌细胞生物学行为的调控。最后,构建人胆囊癌细胞裸鼠移植瘤模型和肝转移模型,检测移植瘤体积变化,HE染色检测移植瘤和肝组织病理损伤情况,TUNEL检测观察移植瘤中细胞凋亡情况,免疫组化检测移植瘤和肝组织中TLR4表达,Western blot检测移植瘤和肝组织中 Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表达。结果:RT-qPCR结果显示胆囊癌组织和细胞中miR-146b-5p表达均显著低于癌旁组织和胆囊上皮细胞;细胞功能性实验结果显示miR-146b-5p mimics能抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进凋亡,而miR-146b-5p inhibitors作用则相反;Western blot实验结果显示miR-146b-5p过表达能显著降低癌细胞中PCNA、Bcl-2、COX-2、MMP-2、MMP-9、N-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达,并提高 Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax、E-cadherin 蛋白表达,而转染 miR-146b-5p inhibitors对以上蛋白表达具有相反作用。双荧光素酶报告显示miR-146b-5p能够与 TLR4 3’-UTR 结合,且 TLR4 与 miR-146b-5p 呈显著负相关（r2=0.9587）;RT-qPCR、Western blot检测均发现胆囊癌组织和细胞中TLR4表达显著高于癌旁组织和胆囊上皮细胞,且miR-146b-5p能调控癌细胞中TLR4mRNA和蛋白表达。回复实验证实TLR4表达的回复减弱了 miR-146b-5p对胆囊癌细胞生物学行为的影响,并且相关蛋白表达水平也发生了显著改变。体内实验结果显示miR-146b-5p mimics能抑制移植瘤生长,减少肝转移结节的数量和改善肝组织病理损伤;TUNEL检测和免疫组化显示miR-146b-5p mimics能提高移植瘤中细胞凋亡率,并降低移植瘤和肝组织中TLR4表达。此外,miR-146b-5p mimics能提高移植瘤中Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表达,降低肝组织中MMP-2和MMP-9蛋白表达。结论:（1）miR-146b-5p在胆囊癌中低表达,其过表达能抑制胆囊癌的恶性进展和体内肝转移。（2）miR-146b-5p通过调控TLR4表达发挥抗胆囊癌作用。
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