稻瘟病菌LXAR效应分子的筛选及功能研究

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稻瘟病是由Magnaporthe oryzae侵染引起的水稻主要病害,是我国乃至世界水稻生产上最重要的病害之一。在严重发病的田块,产量损失高达80%,甚至颗粒无收,严重影响粮食的产量与质量。要防治稻瘟病,就要加深对水稻与稻瘟病菌互作调控机制的了解。LXAR效应蛋白的发现以及对这类蛋白功能的阐述为研究稻瘟效应分子从寄主细胞外进入细胞内的分子机制奠定了基础,对于研究利用水稻抗瘟性以及近一步认识和防治该类病害也具有重要意义。在稻瘟外泌蛋白中存在一类LXAR-type效应蛋白,其在病原物与植物互作过程中具有抑制植物防卫反应的作用。通过生物信息学分析发现,稻瘟菌株70-15基因组中含有162个LXAR-tpye类效应分子。为了确定这些候选效应分子在抑制植物防卫反应中的作用,以及效应分子中LXAR基序的功能,本研究以小鼠促凋亡蛋白BAX为诱导因子,采用PVX病毒表达载体在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中表达了45个不含内含子的候选LXAR效应分子,通过分析这些效应分子对BAX诱导的过敏性细胞死亡的抑制作用,从中筛选到14个能够显著抑制BAX诱导的HCD的LXAR效应分子,这些效应分子去信号肽后抑制效果大部分比不去信号肽要明显。此外,还观察到2个效应蛋白具有诱导烟草细胞死亡的功能。这些结果表明稻瘟病菌中有些LXAR效应分子可能起到毒性功能抑制植物的防卫反应,而还有一部分效应分子却可激活寄主防卫反应。同时为了进一步评价LXAR基序的功能,本研究随机挑选了3个能抑制BAX诱导的HCD的效应分子,将其去信号肽序列及全长序列中的LXAR基序均突变成AAAA,通过农杆菌介导注射烟草发现,其中两个效应分子的去信号肽序列和全长序列突变体编码的蛋白仍然能明显抑制BAX诱导的HCD,而另外一个效应分子去信号肽突变体能抑制BAX,但不去信号肽的全长突变体完全不能抑制BAX诱导的HCD。这表明将效应分子从胞外引导入胞内的并不仅仅是LXAR这四个氨基酸,其中可能还存在更加复杂的机制。稻瘟病菌的LXAR效应分子除了包含许多能够抑制植物细胞过敏性反应的效应因子外,还包括能诱导植物HR的激发子。病原菌分泌的激发子作为一类重要的信号分子可以诱导植物的防卫反应。在植物细胞的原生质膜上存在着特异高度亲合的蛋白质受体,当激发子与植物受体蛋白结合后,使相关的抗病基因表达,从而诱发防御反应。本章就研究内容第一章中筛选到的含有信号肽和LXAR(?)基序的激发子part15248与part24474(?)勺功能进行了初步分析。通过基于PVX载体的病毒表达系统注射本氏烟,发现这两个基因的编码产物能够在烟草上引发HR,但这种HR能被其他能抑制BAX的LXAR效应蛋白抑制,同时这两个激发子也能在拟南芥上引起HR。在酵母细胞中异源表达时,发现它们能显著降低酵母细胞的存活率。
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