哺乳动物卵母细胞成熟是由外界信号刺激产生的细胞周期转换过程,该过程中存在两次自发的停滞现象,并可被外界信号诱导恢复,最终引起细胞内的基因转录和蛋白质合成。早期胚胎发育起始于受精完成、合子基因组激活(zygotic genome activation,ZGA),大量胚胎早期基因的表达和修饰都发生在这一时期。转录因子(transcription factors,TFs)是RNA聚合酶催化基因转录时所必需的。TFⅡB主要参与转录起始复合物的装配,并作为桥梁介导结合TFⅡD的启动子区与RNA聚合酶Ⅱ之间的连接,调节转录复合物中RNA聚合酶Ⅱ催化中心的活性。此外,TFⅡB还被认为是许多转录调控因子结合的靶蛋白,在转录调节中具有重要的作用。α-微管蛋白(α-tubulin)是构成纺锤体的基本骨架分子之一,在细胞分裂过程中直接影响染色体的行为,同时还能参与各种蛋白质之间的相互作用。本研究比较了BAF155、Brg-1、HDAC2、HP1β、TAFⅡ、TFⅡB、TFⅡD、TopoⅡα和TopoⅡβ等九种转录因子在小鼠卵母细胞成熟过程中的动力学变化,并系统研究了转录因子TFⅡB在小鼠卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中的作用,在此基础上对牛克隆胚胎异常发育过程中转录因子的变化进行了初步探讨。实验成果对于深入理解转录因子在减数分裂和早期胚胎发育中的调控作用及相关机制具有重要的参考价值,主要研究结果如下:　　 1.转录因子在小鼠卵母细胞中的分布　　 通过细胞免疫荧光染色的方法,对九种转录因子在不同成熟阶段小鼠卵母细胞中的动态分布变化进行分析。结果发现,生发泡(germinal vesicle,GV)期卵母细胞中的转录因子集中分布于GV核内,减数分裂恢复后,转录因子的分布呈现两种完全不同的趋势:其中,HDAC2、HP1β、TAFⅡ、TFⅡB和TopoⅡα仍然集中在染色体周围,形成与纺锤体的共分布；而BAF155、Brg-1、TFⅡD和TopoⅡβ则是均匀地分布在细胞质中。根据实验结果初步推断,与纺锤体共分布的转录因子多数直接参与基因转录起始装置的组装和染色体结构的修饰,而参与转录活性调节的各种激活／抑制因子主要分布于细胞质中,只有当其结合位点暴露时才重新聚集并结合到染色体上。　　 2.减数分裂中TFⅡB与α-tubulin的动力学关系以及TFⅡB对小鼠卵母细胞成熟的影响　　 使用微管特异性药物秋水酰胺对MⅡ期小鼠卵母细胞进行处理,结果发现纺锤体被破坏而严重变形,但是这种结构上的变化并未引起TFⅡB与其相对位置的改变；通过构建双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)表达载体pHA-tf2b与pFlag-tuba1α,对小鼠胎儿成纤维细胞进行共转染的实验结果呈阳性,表明二者在空间结构或分布上确实存在联系。为了进一步研究TFⅡB对卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响,我们采用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术对TFⅡB的表达进行敲减。Real Time RT-PCR和Westernblot检测结果显示,大约在注射siRNA6h后,tf2b mRNA的水平开始降低,并且siRNA注射组中TFⅡB表达量明显低于对照组。但是,TFⅡB表达量的下降并没有引起成熟率的显著降低(P>0.05)。　　 3.TFⅡB对小鼠胚胎早期发育的影响　　 GV期卵母细胞经过注射tf2b siRNA之后,体外培养至MⅡ期,并用SrCl2对成熟卵母细胞进行孤雌激活。结果发现,从GV期开始干扰TFⅡB的表达时,会引起囊胚率的显著降低(P<0.01),并出现2-细胞早期发育阻滞；而在MⅡ期减少tf2b mRNA的表达,则不会影响早期胚胎的发育率(P>0.05)。由上述结果推测,原核期到2-细胞早期胚胎中转录因子表达量的减少,会造成合子基因组激活异常,进而引起胚胎发育停滞；一旦合子基因组转录得以完全启动,对转录因子的干预就不会使胚胎发育产生明显的阻抑,但可能会影响部分早期基因的表达,使囊胚质量有所下降。　　 4.转录因子变化对牛克隆胚胎发育的影响　　 利用细胞免疫荧光染色技术,分别对形态正常和异常的牛克隆胚胎进行了九种转录因子(BAF155、Brg-1、HDAC2、HP1β、TAFⅡ、TFⅡB、TFⅡD、TopoⅡα和TopoⅡβ)分布与变化的研究。结果发现,在形态正常的克隆胚胎中能够检测到转录因子的表达,而且转录因子的分布符合之前实验中得出的规律,而发育异常胚胎中的染色体排列混乱,有些转录因子的表达及分布偏离正常水平。例如,在异常胚胎中无法检测到TAFⅡ、TFⅡB的特异性信号,而胞质分布的Brg—1表现为与纺锤体的共定位,同时其他各种转录因子的表达水平都有不同程度的降低。这一结果表明,克隆胚胎中转录因子的缺陷可能是引起胚胎发育异常的因为之一。