目的:卒中是全球人类残疾和死亡的主要的原因,缺血性梗死是其最常见的亚型之一。溶栓和机械取栓虽然有效,但仅限于急性期治疗。与之相比,缺血后脑组织的修复及其可塑性能够为多种治疗方法提供长达数月的治疗时间窗。缺血性梗死后脑组织的修复及其可塑性包括神经元发生,轴突再生,少突胶质细胞,前体细胞发生及少突胶质细胞髓鞘化等,这与其运动功能恢复密切相关。寻求一种有效的能够增强缺血性梗死后脑组织修复及其可塑性,进一步促进缺血性梗死后功能恢复的治疗方法对缺血性梗死患者运动功能的恢复至关重要。肠道微生物影响神经生理和行为学,肠道细菌也可通过调节宿主代谢产物,影响中枢神经系统(central nervous system,CNS)功能。代谢产物可以通过血脑屏障(blood brain barrier,BBB)进入中枢神经系统直接影响神经活动。肠道营养支持已被应用在脑梗死患者中,长期的肠道营养可以塑造肠道微生物群落,也可以影响宿主的免疫肠道营养,这些作用可能对脑梗死的预后产生积极的影响。高膳食纤维饮食(High fiber diet,HFD),是近年来最被广泛应用的肠道营养干预之一,在高血压,糖尿病,炎症性肠病等临床实验已充分证实其有益作用。高膳食纤维饮食可以改善菌群,促进益生菌的生长,有利于改善胃肠道环境和维护肠道菌群平衡,最重要的益生菌乳酸菌和双歧杆菌,在动物和临床研究的结果表明,益生菌能够降低焦虑和抑郁、提高认知能力,改善自闭症、多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)、阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease,AD)和帕金森症(Parkinsonism Disease,PD)等,有益于人类的心理健康。高膳食纤维饮食可以被肠道菌群代谢发酵产生短链脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)。SCFAs在多种中枢神经系统疾病中发挥作用,其作为菌群和免疫之间的桥梁介导疾病发生发展。研究表明SCFAs在CNS免疫中有调节作用,SCFAs可以直接促进T细胞分化成Treg或树突状细胞(dendritic cells,DC),这些影响是由SCFAs在宿主中的受体,G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)和或组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)介导的。因此,我们将分别应用进行HFD,肠道菌群移植,SCFAs饮水,益生菌干预研究肠道菌群及其代谢产物调节缺血后大鼠慢性恢复期神经再生,凋亡和运动功能的影响。研究方法:1、本研究首先利用16s rRNA的方法对假手术组(SHAM组),缺血组(ISC组),缺血+高膳食纤维饮食组(ISC+HFD组),缺血+SCFAs饮水组(ISC+SCFAs组),缺血+益生菌组(ISC+PB组),缺血+肠道菌群移植组(ISC+TRANS组)的肠道内容物进行了分析。2、通过短链脂肪酸靶向代谢组学对各组盲肠内容物进行定量分析。3、通过圆筒,粘贴,平衡木实验对各组动物行为学表现进行评估。4、通过免疫荧光,免疫组化,流式细胞术分析各组小胶质细胞的表型和形态。5、通过免疫荧光,免疫组化,Western Blot和流式细胞术检测各组动物神经发生,凋亡情况。6、通过PCR array技术对小胶质细胞的炎症免疫因子的变化,对侧脑室下区(subependymal ventricular zone,SVZ)神经再生相关因子进行初筛,并用Western Blot的方法对Toll样受体-2(Toll-like receptor-2,TLR2),Toll样受体-4(Toll-like receptor-4,TLR4),核因子kappa-B(nuclear factor kappa-B,NF-?B),Ras,环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB),p-CREB,细胞外信号调控激酶(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2),p-ERK1/2,P38,p-P38,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK),p-JNK,在翻译水平的表达进行验证。7、在分子机制研究中,通过Western Blot方法检测SCFAs作用活化小胶质细胞后TLR2,TLR4,NF-?B和p-NF-?B的表达变化来初步分析NF-?B信号通路在SCFAs作用后的激活情况。并用RT-qPCR检测添加ERK1/2信号通路抑制剂和JNK信号通路抑制剂前后的炎症因子的表达情况以及通过Western Blot方法检测ERK1/2和JNK通路蛋白水平变化来探究丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路在SCFAs调节小胶质细胞炎性反应中发挥的作用。8、最后,用小胶质细胞上清对神经干细胞进行条件性培养,免疫酶联试验(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)检测小胶质细胞胞浆中脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和神经营养素3(Neurotrophins,NT3)蛋白浓度,免疫荧光检测神经再生及分化情况。结果:1、HFD应用后,乳酸菌属(Lactobacillus)明显上调,占据菌群组成90%以上。ISC+HFD鼠的粪菌移植组即ISC+TRANS组大鼠,厌氧菌更易在肠道中定植,所以不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、孪生球菌(Gemella)、苍白杆菌(Ochrobactrum)、链球菌(Streptococcus)等菌群明显增加,而乳杆菌属(Lactobacillus)丰度并未明显增加;ISC+PB组应用菌群双歧杆菌,乳酸菌和链球菌灌胃,菌群结果显示乳酸菌和链球菌较ISC组明显增加;且梭菌属(Clostridium),普氏菌(Prevotella),瘤胃菌科(Ruminococcaceae)比例明显增加。ISC鼠和ISC+PB组门水平上菌群组成类似,而ISC+TRANS和ISC+HFD组菌群组成类似。2、结合代谢结果,ISC+TRANS组SCFAs水平上调并不明显,ISC+SCFAs组和ISC+PB组SCFAs水平上调明显。3、行为学结果表明HFD,SCFAs和益生菌的应用明显改善了缺血性脑梗死后运动感觉功能恢复。4、流式,RT-qPCR和免疫荧光结果表明SCFAs应用促进了小胶质细胞活化和炎性反应,但对小胶质细胞的形态无明显影响。5、SCFAs应用可增加Nestin+细胞比例和数量,促进SVZ区神经干细胞再生,但对神经凋亡无明显影响。6、TLR和神经发生信号通路PCR array结果表明SCFAs应用后小胶质细胞MAPK信号通路上相关基因的表达明显上调,皮层中小胶质细胞中MAPK通路上IL1R1,TNF,MAP2K3,JUN,MAP3K1,TNF受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF6)基因明显上调。结果说明SCFAs应用增加小胶质细胞的炎性反应,同时可以上调BDNF和NT3等神经营养因子,DCX和Olig2等神经发生分子的表达。7、SCFAs抑制NF-?B信号通路活化,但可促进小胶质细胞中JNK通路,而非ERK1/2通路活化产生炎性因子。8、体外实验结果表明SCFAs通过促进小胶质细胞分泌炎性因子,BDNF及NT3等神经营养因子促进神经发生。结论:1、HFD应用ISC大鼠后促进肠道产生益生菌,增加肠道内容物中SCFAs含量。2、SCFAs通过调节神经发生而非神经凋亡促进神经功能恢复。3、SCFAs促进小胶质细胞活化和炎性反应。4、SCFAs抑制小胶质细胞NF-?B信号通路,促进JNK通路激活参与SCFAs促进细胞分泌炎性因子和神经营养因子这一过程。