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目的:恶性黑素瘤（简称黑素瘤）,是来源于黑素细胞的恶性肿瘤。由于包括TRP2在内的多种黑素瘤相关抗原的不断发现,以及部分黑素瘤患者中发现肿瘤自发消退现象表明机体免疫系统能够清除肿瘤细胞,该肿瘤已被作为肿瘤免疫治疗的模式疾病。然而,TRP2等黑素瘤相关抗原的免疫原性低,肿瘤疫苗的疗效甚微。本研究旨在构建基于GM-CSF和MIP-1α的真核表达载体作为分子佐剂,建立基于TRP2的黑素瘤DNA疫苗,并在多种系统中进行验证,从而为进一步探索黑素瘤等相关肿瘤的免疫治疗打下基础。方法:利用RT-PCR法从小鼠脾脏总RNA中分别扩增小鼠GM-CSF和MIP-1α基因的cDNA,并将其与载体pVAX1连接,构建相应的真核表达载体。同时,以RT-PCR法从B16F10总RNA中扩增小鼠TRP2基因的cDNA,并将其与载体pEGFP-N1连接,构建其真核表达载体。所有载体经测序验证正确。将重组质粒分别转染到HeLa细胞中,ELISA方法鉴定GM-CSF的表达,骨髓细胞集落形成法测定其生物活性;TRP2的表达以免疫印迹法鉴定,并以激光共聚焦显微镜观察其在HeLa细胞中的表达及亚细胞定位;通过冰冻切片和HE染色检测小鼠GM-CSF和MIP-1α重组质粒的体内生物学活性。结果:1.从C57BL/6小鼠中成功克隆小鼠GM-CSF、MIP-1α和TRP2的编码区cDNA,分别构建了三种基因的真核表达载体,经测序分析显示,GM-CSF和MIP-1α的cDNA序列与GenBank的序列完全一致;TRP2的cDNA有1个核苷酸发生突变（T1441C）,对应的氨基酸有一个不同（F481L）,为保守突变,不影响其优势T细胞表位TRP2180-188（SVYDFFVWL）;通过SignalIP软件预测分析小鼠TRP2的第1～23个氨基酸为潜在的信号肽;TMpred软件预测第473～493个氨基酸为潜在的跨膜区,F481L突变位于跨膜区。2.GM-CSF真核表达载体在HeLa细胞中转染表达,24h和48h后表达的GM-CSF浓度分别为6.71 ng/mL和42.19 ng/mL;表达小鼠GM-CSF的HeLa细胞培养上清能够明显刺激骨髓细胞增殖并形成集落;GM-CSF和MIP-1α表达载体在小鼠体内均可以引起局部免疫细胞的增多。3.TRP2真核表达载体转染HeLa细胞后,Western Blot显示TRP2获得表达;激光共聚焦显微镜观察到转染细胞发出较强绿色荧光,与EGFP均匀分布的绿色荧光不同,TRP2-EGFP融合蛋白主要定位于细胞内膜系统中,呈现明显的分布集聚。结论:成功构建了小鼠GM-CSF、MIP-1α和TRP2的真核表达载体,并在HeLa细胞中能够进行表达;体外表达GM-CSF具有明显的生物学活性,GM-CSF和MIP-1α表达载体在体内也能促进免疫细胞的增多。这些结果提示,GM-CSF和MIP-1α的表达载体可以作为分子佐剂用于体内研究,而TRP2表达载体则可以作为治疗黑素瘤的DNA疫苗进行深入研究。