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目的:本课题通过体内实验方法,探讨基于温肺补气通络法加味补阳还五汤治疗间质性肺疾病作用机制,以Fas/FasL信号传导通路为切入点,深入细胞凋亡层面研究相关凋亡因子及炎症因子蛋白表达量的变化,探索加味补阳还五汤对博来霉素大鼠抗肺纤维化作用效果及机制,为基于温肺补气通络法加味补阳还五汤治疗间质性肺疾病提供药效学研究依据,为临床研究奠定基础。方法:1、加味补阳还五汤对肺纤维化大鼠模型病理形态学的影响体内抗肺纤维化实验采用动物模型法,动态观察大鼠一般情况,依据HE、Masson染色病理学检查方法评价肺组织肺泡炎程度,探讨加味补阳还五汤抗肺纤维化的作用。以空白正常组、博来霉素模型为模型对照组、阳性药物强的松组,加味补阳还五汤分为高、中、低剂量组,每组20只。给予肺纤维化模型高、中、低浓度加味补阳还五汤剂量组大鼠灌胃中药,进行中药干预,并与模型对照组、阳性药物组对比分析。2、加味补阳还五汤对肺纤维化大鼠血清中TNF-α、TGF-β及HMGB1的研究博来霉素肺纤维化模型各组大鼠分别于第7d、14d、28d,取材检测。采用酶联免疫吸附测定法检测各实验组各时间点TNF-α、TGF-β和晚期炎症因子HMGB1表达量的变化。3、加味补阳还五汤对肺纤维化大鼠肺组织Fas、FasLmRNA表达影响的研究采用免疫组化技术、实时荧光定量PCR及Western blot的方法,观察加味补阳还五汤对博来霉素肺纤维化模型各组大鼠肺组织中Fas、FasLmRNA蛋白表达情况。4、加味补阳还五汤对肺纤维化大鼠肺组织Caspase-3的影响流式细胞仪法、Western blot法检测大鼠肺组织中Caspase-3含量。结果:1、加味补阳还五汤对肺纤维化大鼠肺组织病理形态学的影响:(1)HE染色:阳性药物组及加味补阳还五汤各剂量组:与模型组比较,各剂量组双肺色泽、体积、硬度、弹性、结节样改变等情况有所好转,第7天,阳性药物组及加味补阳还五汤高、中剂量组与模型组相比较具有显著差异(P<0.01或P<0.05)。第14天,阳性药物组及加味补阳还五汤高剂量组与模型组相比较具有显著差异(P<0.01或P<0.05)。第28天,加味补阳还五汤高剂量组与模型组相比较具有显著差异(P<0.01)。阳性药物组与加味补阳还五汤高剂量组相比较,在各时间点肺泡炎积分均无显著差异(P>0.05)。(2)Masson染色:染色结果可见胶原纤维呈绿色,肌纤维呈红色,红细胞呈橘红色。14天Masson染色结果显示,模型组肺泡间隔增宽,肺间质成纤维细胞增多,胶原纤维增多形成弥漫性肺纤维化。阳性药物组及加味补阳还五汤各剂量组染色结果较模型组比较有明显变化,肺间质成纤维细胞减少,肺泡间隔变窄,肺纤维化正在减轻。2、加味补阳还五汤对肺纤维化大鼠血清中TNF-α、TGF-β及HMGB1的研究:(1)TNF-α:与BLM模型组比较阳性药物组及加味补阳还五汤各剂量组中TNF-α的表达均不同程度下降,BLM模型组大鼠气管上清液和血清中TNF-α蛋白表达水平显著增加(P<0.001);中剂量组、高剂量组及阳性药物组气管上清液和血清中TNF-α蛋白表达量显著下降(P<0.01);与BLM模型组相比加味补阳还五汤中剂量组、高剂量组和药性药物组TNF-α的表达在各样本中均有显著差异(P<0.01);高剂量组和阳性药物组在不同时间点不同样本中TNF-α表达量差异不显著(P>0.05)。第14天,低剂量组气管上清液中TNF-α表达量同BLM模型组相比显著下降(P<0.01);(2)TGF-β:BLM模型组大鼠气管上清液和血清中TGF-β蛋白表达水平显著增加(P<0.001);与模型组相比,中剂量组、高剂量组及阳性药物组气管上清液TGF-β蛋白表达量显著下降(P<0.01);与BLM模型组相比加味补阳还五汤高剂量组和阳性药物组TGF-β的表达在各样本中均有显著差异(P<0.01);高剂量组和阳性药物组在不同时间点和不同样本中TGF-β表达量无显著差异(P>0.05)。在第14和第28天,中剂量组血清中TGF-β表达量同BLM模型组相比差异不显著(P>0.05);(3)HMGB1:与BLM模型组比较,各时间点阳性药物和加味补阳还五汤中、高剂量组均显著降低大鼠HMGB1含量(P<0.001);在第7、14、28天加味补阳还五汤高剂量组与阳性药物组比较差异不显著(P>0.05);这显示出高剂量加味补阳还五汤在抑制HMGB1方面效果同阳性药物组一致;加味补阳还五汤高剂量组效果明显优于中、低剂量组。3、加味补阳还五汤对肺纤维化大鼠肺组织Fas、FasLmRNA表达影响的研究:(1)免疫吸附法:阳性药物组及加味补阳还五汤各剂量组:Fas蛋白表达在第7天、14天、28天,在肺间质及肺泡壁周围均有Fas阳性表达,与模型组比较表达具有显著差异(P<0.05或P<0.01)。加味补阳还五汤各剂量组与强的松组比较,均无显著差异(P>0.05)。(2)Western blot:肺组织Fas、FasL蛋白表达与模型组比较,加味补阳还五汤高、中、低剂量组蛋白表达水平均有不同程度降低。加味补阳还五汤高剂量组能够有效抑制肺组织Fas、FasL蛋白的表达,效果同阳性药物组无明显差异。(3)qRT-PCR:阳性药物组及加味补阳还五汤各剂量组FasmRNA表达在第14天,阳性药物组及加味补阳还五汤高、中剂量组与模型组相比较,均有显著差异(P<0.001);加味补阳还五汤低剂量组与模型组比较无显著差异(P>0.05)。FasLmRNA表达在第14天,阳性药物组及加味补阳还五汤各剂量组与模型组相比较均有显著差异(P<0.001);加味补阳还五汤低剂量组与模型组相比较无显著差异(P>0.05)。加味补阳还五汤高剂量组与阳性药物组在无显著差异(P>0.05)。4、加味补阳还五汤对博来霉素大鼠肺组织细胞凋亡因子Caspase-3的影响研究:(1)流式细胞仪:流式细胞仪法检测大鼠组织中Caspase-3含量,加味补阳还五汤各剂量组肺组织中Caspase-3含量较模型对照组均有所降低。其中,加味补阳还五汤高、中剂量组抑制Caspase-3释放。加味补阳还五汤高剂量组Caspase-3含量与阳性药物组比较无显著性差异。(2)Western blot:造模组Caspase-3蛋白表达量在第7、14、28天均呈现上调,在实验第14天,中药干预组效果最明显,Caspase-3蛋白表达量同中药剂量呈现明显的正相关,高剂量加味补阳还五汤显著抑制Caspase-3的表达,效果同阳性药物组一致。结论:1、加味补阳还五汤明显减轻肺纤维化模型大鼠肺泡炎的炎症及肺纤维化的形成,其作用与糖皮质激素类似。目前,需要开拓间质性肺疾病新的治疗方案,积极开展加味补阳还五汤对间质性肺疾病的干预机制研究具有重要意义。2、加味补阳还五汤高剂量组对肺泡炎及肺纤维化的抑制,减少Fas,FasLmRNA,TGF-β,HMGB1因子的表达,明显优于中、低剂量组。因此,加味补阳还五汤高剂量组对肺纤维化的防治有着较好的量效关系,这可能是最适宜的临床应用和防治剂量。3、加味补阳还五汤通过抑制肺纤维化模型大鼠血清中TNF-α的表达,改善肺泡炎;通过抑制肺纤维化模型大鼠肺组织中TGF-β,HMGB1,Fas,FasLmRNA,HMGB1的表达,改善细胞外基质的异常代谢,抑制凋亡因子Caspase-3释放,阻止成纤维细胞的增殖、复制,从而达到控制肺纤维化的目的,这可能是加味补阳还五汤防治肺纤维化的作用机制之一。