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目的内脏痛觉过敏是炎症性肠病（IBD）患者腹痛发生的主要病理生理机制,其确切的分子机制尚未完全阐明。利用小鼠实验性结肠炎模型和体外培养的小鼠来源神经瘤母细胞（Neuro-2a）,本研究旨在（1）明确脊髓趋化因子CCL8及其主要受体CCR5在内脏痛觉过敏中的作用和可能的机制;（2）研究脊髓miR-146a-5p在内脏疼痛过程中的功能及其对CCL8和下游信号的调控作用。方法（1）小鼠结肠内灌注2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）以诱导结肠炎。（2）疾病活动指数（DAI）、结肠髓过氧化物酶（MPO）活性及苏木素-伊红（HE）染色法用于鉴定结肠炎症。（3）小鼠接受结直肠扩张（CRD）测定内脏疼痛阈值以评估内脏高敏感性（内脏痛觉过敏）。（4）采用实时荧光定量PCR（q PCR）检测miR-146a-5p表达和CCL8、CCR5、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）m RNA水平。（5）采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测CCL8蛋白水平。（6）采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测CCR5蛋白、磷酸化细胞外信号调节激酶（pERK）蛋白表达。（7）采用免疫荧光双染色法,确定CCL8、CCR5和pERK在脊髓背角的细胞定位。（8）采用荧光原位杂交结合免疫荧光双标染色的方法,明确miR-146a-5p在脊髓背角的细胞定位。（9）通过生物信息学分析预测miR-146a-5p的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因分析进行验证miR-146a-5p和CCL8之间的关系。（10）Neuro-2a细胞转染miR-146a-5p模拟物或抑制剂,以检测miR-146a-5p对CCL8及其下游信号的影响。（11）鞘内注射CCL8中和抗体、CCL8小干扰RNA（siRNA）、CCR5拮抗剂DAPTA、ERK激酶（MEK）抑制剂PD98059、重组小鼠趋化因子CCL8、miRNA-146a-5p激动剂或拮抗剂,测定内脏疼痛阈值,以确定脊髓CCL8、CCR5、ERK或miRNA-146a-5p在结肠炎引起的内脏痛觉过敏中的作用。结果（1）TNBS灌肠诱导结肠炎症,表现为DAI和结肠MPO活性在第3、7、10d升高。TNBS小鼠结肠组织HE染色显示黏膜受损,并伴有大量的炎症细胞浸润。TNBS灌肠后第7d结肠组织中促炎细胞因子包括TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA表达显著增加。（2）TNBS诱导明显的内脏痛觉过敏,表现为内脏疼痛阈值在第3d下降,至第7d最低,第10d仍较低,第14 d恢复。（3）TNBS小鼠腰骶段脊髓CCL8mRNA和蛋白水平在灌肠后第3d升高,第7d达到峰值,第10d下降,第14 d恢复到基础水平。CCL8表达的时间过程与疼痛行为的时间过程是平行的。上调的CCL8主要定位于脊髓背角神经元,而不是星形胶质细胞或小胶质细胞。TNBS灌注后第7d鞘内单次注射CCL8中和抗体增加内脏疼痛阈值,呈剂量依赖性和时间依赖性。同样地,在TNBS灌注后第7d鞘内注射CCL8 siRNA（两次注射,间隔12小时）,不仅抑制脊髓CCL8mRNA和蛋白表达,而且明显减轻疼痛行为。（4）TNBS小鼠腰骶段脊髓CCR5mRNA和蛋白水平在第3、7、10d显著升高,第14d恢复正常。脊髓背角的CCR5主要表达于神经元,而不是星形胶质细胞或小胶质细胞。TNBS灌肠后第7d,单次鞘内注射CCR5拮抗剂DAPTA,以剂量依赖性和时间依赖性的方式减轻结肠炎引起的内脏痛觉过敏。（5）TNBS灌肠后第7d,腰骶段脊髓pERK表达增加,且定位于神经元。单次鞘内注射MEK抑制剂PD98059部分逆转TNBS诱导的内脏高敏感性。此外,TNBS后第7d鞘内注射CCL8中和抗体或CCR5拮抗剂DAPTA,显著逆转TNBS小鼠脊髓pERK的上调。（6）鞘内注射重组小鼠趋化因子CCL8诱导正常小鼠发生内脏痛觉过敏和脊髓ERK活化。预先鞘内注射CCR5拮抗剂DAPTA可部分阻止重组CCL8引起的内脏疼痛以及脊髓pERK的增加。鞘内MEK抑制剂PD98059部分缓解重组CCL8引起的内脏疼痛阈值的降低。（7）重组小鼠CCL8诱导培养的Neuro-2a细胞ERK激活。CCR5拮抗剂DAPTA预孵育减少了CCL8诱导的pERK的高表达。（8）TNBS灌肠后第3d到第14 d,腰骶段脊髓miR-146a-5p表达逐渐增加,且主要表达于脊髓背角神经元。（9）生物信息学分析预测CCL8是miR-146a-5p的一个潜在靶基因。双荧光素酶报告检测证实miR-146a-5p通过直接靶向CCL8mRNA 3’-非翻译区域（3’-UTR）抑制CCL8表达。（10）Neuro-2a细胞转染miR-146a-5p模拟物以过表达miR-146a-5p,能抑制TNF-α诱导的CCL8mRNA和蛋白水平的上调。相反,转染miR-146a-5p抑制剂能诱导Neuro-2a细胞CCL8mRNA和蛋白高表达以及ERK激活。（11）重复鞘内注射miR-146a-5p激动剂（TNBS灌肠后第4-6 d,每天一次）以增加脊髓内源性miR-146a-5p表达,不仅抑制脊髓CCL8高表达和ERK活化,而且减轻TNBS诱导的内脏痛觉过敏。（12）正常小鼠重复鞘内注射miR-146a-5p拮抗剂（连续3d,每天一次）,增加脊髓CCL8表达并激活ERK信号,诱导内脏疼痛发生。在重复注射miR-146a-5p拮抗剂后,鞘内注射CCL8中和抗体能部分缓解miR-146a-5p拮抗剂诱导的内脏高敏感性并抑制ERK激活。结论（1）结肠炎诱导内脏痛觉过敏,伴随脊髓神经元CCL8及其受体CCR5表达增加。上调的CCL8通过CCR5激活神经元ERK信号通路,参与结肠炎诱导的内脏疼痛。抑制脊髓CCL8/CCR5/ERK生物轴减轻结肠炎诱导的内脏痛觉过敏。（2）结肠炎诱导脊髓神经元miR-146a-5p表达逐渐增加,CCL8是miR-146a-5p的潜在靶基因。过表达miR-146a-5p通过靶向抑制脊髓CCL8表达及其下游ERK信号,对结肠炎引起的内脏痛觉过敏发挥负调控作用。（3）本研究结果首次阐明了脊髓miR-146a-5p及其靶基因CCL8对结肠炎内脏痛的调节作用及机制,为揭示IBD患者腹痛的中枢机制提供了理论依据。miRNA-146a-5p和CCL8有望成为IBD腹痛治疗的潜在靶点。