从上世纪九十年代初期,由于环境污染日趋严重,水源水质变差。自来水质量下滑、二次污染加剧、人们生活水平的提高及自我保健意识的增强等因素,引起人们对饮水质量的高度重视,使人们对洁净水的要求越来越高。由此经深度加工如:反渗透、纳滤、超滤、吸附、交换、氧化等处理的新型软饮水不断涌现。它们在除去污染物的同时,也将有益的矿物质元素去掉,因此它们含有极少或不含矿物质元素。据调查目前西方发达国家90%家庭生活用水(包括烹饪、洗涤等)都是软水。我国的新型饮用水企业,有90%左右的都是生产低矿物质软水。此外,全球大约有1/5的家庭以瓶装水作为主要饮水,而这些瓶装水约有一半是低矿物质软水。可见低矿物质软水在现代生活中的地位会越来越重要。多年来大量流行病学调查研究发现饮水的硬度特性与心血管疾病(心脏病、动脉粥样硬化、高血压和中风)以及其它几种疾病之间呈负相关。还有研究证明饮水中某些矿物质元素能与其它元素或蛋白质争夺结合位点,影响细胞膜的渗透性或者通过其它代谢作为酶反应的活化剂或抑制剂,在若干生物过程中发挥重要作用,从而对人体健康造成影响。也有相关研究报道认为饮用低矿物质软水对健康无不利影响。他们认为人体矿物质仅有10~20%来源于饮水,绝大部分可以从食物补充。饮水的意义仅在于补充水分。由于饮水硬度与健康的关系涉及因素复杂,且研究过程中存在地域、性别、种族、水质、实验方法及现场研究上的差异,出现不少结论上的偏差。因此,饮用低矿物质软水对健康有无负面影响,至今仍无定论。本研究团队自1998年起关注长期饮用软水对健康的影响。前期一系列动物实验结果显示长期饮用低矿物质软水能使血脂代谢关键指标(TC、TG、LDL-C)及载脂蛋白B(apoB)浓度升高、脂蛋白关键酶(LCAT、LPL、HL)活性降低;同时肝脏apoB mRNA表达水平出现升高趋势,apoAⅠmRNA、LDLR mRNA表达水平出现下降趋势。此外,我们还观察到血清丙二醛(MDA)、内皮素(ET-1)含量升高等与氧化应激失衡的改变。在另一项动物实验研究中发现大鼠饮用低矿物质水28周后,可引起血清NO、尿素、肌苷、蛋白氮含量降低,MDA含量显著升高,并且在蛋白质谱筛查中发现大鼠肝脏中精氨酸酶表达显著降低。精氨酸酶(Arginase)是机体鸟氨酸循环中的一种分解酶,以精氨酸为底物将其分解成尿素和鸟氨酸,鸟氨酸进一步代谢产生多胺、脯氨酸等,刺激血管平滑肌细胞增殖和胶原沉积导致血管内皮损伤。根据实验和文献报道我们推测精氨酸酶及其相关蛋白可能在软水和心血管损伤之间起着分子桥梁作用。并且迄今为止国内外文献未见有关低矿物质软水与心血管疾病之间分子事件的解读研究。鉴于前期动物实验发现长期饮用低矿物质水可诱导血脂指标异常,因此我们选择对高脂代谢敏感的新西兰兔为观察对象,以低矿物质水作为软水的代表,模拟现代高脂饮食,全面探讨高脂食物与低矿物质软水联合对心血管产生影响的分子机制,着重观察①血脂代谢关键指标(TC、TG、LDL-C、HDL-C、apo-A、apo-B)和氧化应激指标(MDA、SOD、NO)改变为重点的研究;②精氨酸酶和NOS在饮用低矿物质软水影响心血管中的效应研究。这对于客观评估长期饮用低矿物质软水与健康的关系,筛选今后可用于人群健康保护的关键分子具有重要意义。实验方法:1、动脉粥样硬化动物模型的建立和不同水质和饲料对兔动脉粥样硬化形成作用的研究。3月龄健康雄性新西兰兔28只,体重(2.4±0.3) kg,室温22℃±2℃、湿度75%±5%条件下适应性饲喂2周后按随机数字表法分为4组,每组7只,分别为:第Ⅰ组:自来水+普通饲料;第Ⅱ组:低矿物质水+普通饲料;第Ⅲ组:自来水+高脂饲料;第Ⅳ组:低矿物质水+高脂饲料;自由饮水,饲养26周。普通饲料按中华人民共和国国家标准“实验动物全价营养饲料”(GB14924-94)要求配制;高脂饲料配方根据国内外文献报道的经典配方配制。自来水水质符合我国国家生活饮用水卫生标准(GB5749-2006);低矿物质水水质(纯净水)符合我国饮用瓶装纯净水国家标准(GB17324-2003)。实验期间,①观察不同水质和饲料联合对新西兰兔饮食量、饮水量、精神、体重、毛发、排泄物等一般情况的影响。②每月抽取耳缘静脉血4ml检测各项血脂指标(TC、TG、LDL-C、HDL-C、apo-A、apo-B)及氧化应激指标(MDA、SOD、NO)情况;实验结束时,放血处死全部实验动物,收集血清、肝脏、心脏及主动脉弓一部分置于4%多聚甲醛固定液中固定,72小时后石蜡包埋备用;另一部分用锡箔纸包裹,置于-70°C冰箱冻存。③在上述模型基础上,大体和HE光镜观察肝脏、心脏及主动脉弓的形态学和病理学变化,并计算动脉粥样指数(AI)。2、不同水质和饲料对兔精氨酸酶及一氧化氮合酶的影响研究④用酶链免疫法检测上述血清标本ET-1水平。⑤和用分光光度计法和酶联免疫法分别检测上述组织(肝脏、心脏及主动脉弓)精氨酸酶与NOS活性。⑥及用逆转录聚合酶链反应(rt-PCR)方法检测精氨酸酶和eNOS基因在各组织(肝脏、心脏)中的表达情况。以上所有实验数据均采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。所有计数资料用χ2检验,所有计量资料除特殊注明外均以均数±标准差(M±SD)表示,用2×2析因设计方差分析。结果与讨论1、建立了动脉粥样硬化动物模型:与普通饲料组比较,高脂饲料(自来水和低矿物质水)组在试验结束时,血清各血脂代谢指标均显著高于正常值,且解剖发现主动脉弓内膜出现明显动脉粥样硬化斑块;而普通饲料(自来水和低矿物质水)组血清各血脂指标正常,解剖未发现主动脉弓内膜有明显异常。2、动物生长发育:与普通饲料组比较,高脂饲料(自来水和低矿物质水)组生长、发育显著较快,体重增加明显(P<0.01);且自来水+高脂饲料组体重明显高于低矿物质水+高脂饲料组(P<0.05)。普通饲料组间无明显差异。提示高脂饲料背景下,长期饮用低矿物质水对动物的生长、发育有一定的减缓作用。3、血脂代谢水平:与普通饲料组比较,高脂饲料(自来水和低矿物质水)组血清各血脂代谢指标(TC、TG、HDL-C、LDL-C、apo-B)水平明显升高(P<0.01);且自来水+高脂饲料组血清各血脂代谢指标水平均明显高于低矿物质水+高脂饲料组(P<0.05)。普通饲料组间无明显差异。提示高脂饲料背景下,长期饮用低矿物质水对动物血脂代谢指标异常有减弱作用。4、氧化水平:与普通饲料组比较,高脂饲料(自来水和低矿物质水)组血清MDA水平显著升高(P<0.01);且自来水+高脂饲料组血清MDA水平明显高于低矿物质水+高脂饲料组(P<0.05)。普通饲料组间无明显差异。结果表明高脂饲料背景下,长期饮用低矿物质水可以一定程度上减弱MDA水平的升高。5、抗氧化水平:与普通饲料组比较,高脂饲料(自来水和低矿物质水)组血清SOD活性及NO水平显著升高(P<0.01);且自来水+高脂饲料组血清SOD活性及NO水平明显低于低矿物质水+高脂饲料组(P<0.05)。普通饲料组间无明显差异。结果表明高脂饲料背景下,低矿物质水一定程度上提高了抗氧化酶活力(SOD)及NO水平,从而减轻机体内的氧化损伤程度。6、ET-1水平和AI值:与普通饲料组比较,高脂饲料(自来水和低矿物质水)组血清水平ET-1及AI值显著升高(P<0.01);且自来水+高脂饲料组血清ET-1水平及AI值明显高于低矿物质水+高脂饲料组(P<0.05)。普通饲料组间无明显差异。结果表明高脂饲料背景下,低矿物质水一定程度上降低了ET-1水平及AI,从而减轻了对血管的损伤。普通饲料组间无明显差异。7、精氨酸酶和NOS活性:与普通饲料组比较,高脂饲料组(自来水和低矿物质水)各组织(肝脏、心脏和主动脉弓)中Arginase活性升高、NOS活性降低(P<0.01);且自来水+高脂饲料组Arginase活性显著高于低矿物质水+高脂饲料组,而NOS活性降低(P<0.05)。普通饲料组间两种酶活性无明显差异。提示高脂饲料背景下,与饮用自来水比较,低矿物质水可减弱Arginase活性,同时上调NOS活性。8、精氨酸酶和eNOS基因表达水平:与普通饲料组比较,高脂饲料组(自来水和低矿物质水)各组织(肝脏、心脏)中Arginase mRNA表达升高、eNOS mRNA表达降低(P<0.01);此外,自来水+普通饲料组Arginase、eNOS mRNA表达均高于低矿物质水+普通饲料组(P<0.05);自来水+高脂饲料组Arginase mRNA表达高于低矿物质水+高脂饲料组,而eNOS mRNA表达降低(P<0.05)。结果提示高脂饲料背景下,与饮用自来水比较低矿物质水可减弱Arginase mRNA表达,同时上调eNOS mRNA表达。普通饲料背景下,与自来水比较低矿物质水可同时减弱Arginase mRNA及eNOS mRNA的表达。9、大体及组织病理学变化:①肝脏肉眼观察,普通饲料组肝脏无明显异常;高脂饲料组整个肝脏呈黄白色,且表面有黄白色变性灶。光镜下,自来水+普通饲料组肝细胞未见明显异常。低矿物质水+普通饲料组肝细胞排列较紊乱,偶见脂肪空泡和炎症细胞侵润。而高脂饲料组肝细胞有不同程度弥漫性空泡样变、假小叶等肝硬化病理改变。比较发现低矿物质水组肝脏病理损伤程度较自来水组轻。提示长期饮用低矿物质水较自来水能在一定程度上减轻高血脂对肝脏的病理损伤。②心脏肉眼观察,4组兔心脏表面均无明显异常。光镜下,普通饲料各组心肌细胞及结构未见明显异常。高脂饲料各组可见血管管腔不同程度的狭窄,血管壁明显增厚等动脉粥样硬化病变。比较发现低矿物质水组心脏病理损伤较自来水组轻。提示长期饮用低矿物质水较自来水能在一定程度上减轻高血脂对心脏的病理损伤。③主动脉弓肉眼观察,普通饲料各组主动脉弓无明显异常;高脂饲料各组主动脉弓内膜出现典型黄白色粥样斑块。光镜下,自来水+普通饲料各组动脉内膜无明显异常。低矿物质水+普通饲料组动脉内膜细胞排列疏松并伴轻度增生。然而高脂饲料各组主动脉弓内膜明显增厚,通过计算AI值发现低矿物质组低于自来水组(P<0.05)。提示长期饮用低矿物质水较自来水能在一定程度上能减轻高血脂对主动脉弓AS的损伤程度。结论与创新性发现1、普通饲料背景下,新西兰兔长期饮用自来水和低矿物质水后,机体血脂指标、氧化应激指标均未观察到有明显差异。2、在高脂饲料导致的动脉粥样硬化模型中,与自来水比较,新西兰兔长期饮用低矿物质水后,在机体血脂代谢紊乱和氧化应激失衡上产生了一定程度的减缓作用。3、无论是普通饲料还是高脂饲料喂养兔子,低矿物质水组与自来水组比较,其组织中Arginase mRNA表达均显著降低;而eNOS在不同的食物背景下有不同的变化;普通饲料背景下,饮用低矿物质水组与饮用自来水组比较,其心、肝、主动脉弓的eNOS mRNA表达显著降低;但在高脂食物背景下,饮用低矿物质水组反而使各组织eNOS mRNA表达显著增加。这是我们首次在兔子实验上发现高脂背景下,长期饮用低矿物质水能在一定程度上减轻血脂代谢紊乱和氧化应激失衡的现象。此外,实验还发现无论饲料高脂与否,长期单纯饮用低矿物质水可减弱兔子Arginase活性,提示它可能是评估影响机体健康的关键分子,这是一个很有意义的发现。这对分析和证实低矿物质饮水与健康的关系之间的分子机制研究有重要意义。我们建议在后续实验中可以选择大鼠或其它种类动物进行观察,以验证各指标的变化情况和排除物种差异的影响。不足由于实验设计及过程中存在不足,以下因素可能对实验结果产生了一定影响。今后研究中应注意严格控制。1、饮水方式动物模型建立阶段,由于实验条件限制未能给予4个组完全相同的饮水方式(低矿物质水组用盛水器皿,自来水用自动饮水喷头)。2、饮水硬度控制本实验只设定低矿物质软水和自来水,未将饮水硬度按高、中、低控制,未能比较到高脂背景下,不同程度的饮水硬度对各指标产生的影响。3、高脂程度控制本实验只按统一高脂标准配制高脂饲料,未按高、中、低程度配制高脂饲料。未能比较到低矿物质软水在不同程度高脂背景下发挥的作用。4、物种差异兔子为食草动物对脂代谢紊乱敏感,与人体代谢存在差异。所以本实验所观察到的效应是否与人类相同,还有待进一步研究和探讨。