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癫痫作为一种常见的脑神经系统疾病,其发病率日趋升高,虽在临床上有较多的治疗方法,但都收效甚微。灵芝酸作为一种高效的灵芝提取物,在各种疾病中都能起到一定的预防、治疗作用。本实验由两个部分组成,通过制备癫痫大鼠模型,观察灵芝酸对癫痫大鼠行为学、形态学及分子生物学等方面的影响,探讨灵芝酸对癫痫大鼠海马神经元的保护作用及其作用机制。第一部分:不同浓度灵芝酸对癫痫大鼠海马神经元Bax、Caspase-3蛋白的影响目的:观察灵芝酸对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元形态的影响,Bax、Caspase-3蛋白的表达变化,脑电图改变,探讨灵芝酸是否具有抗癫痫作用及其作用机制。方法:选取SD大鼠50只,随机分为5组。A组:对照组,给予生理盐水腹腔注射。B组:癫痫模型组,给予锂-匹鲁卡品腹腔注射后造成大鼠快速癫痫模型,并给予生理盐水替代灵芝酸腹腔注射。C组:低浓度灵芝酸干预组,于造模前30min给予低浓度灵芝酸腹腔注射。D组:中浓度灵芝酸干预组,于造模前30min给予中浓度灵芝酸腹腔注射。E组:高浓度灵芝酸干预组,于造模前30min给予高浓度灵芝酸腹腔注射。各组给药后,观察大鼠发作程度及行为变化,视频脑电观察各组大鼠脑电图变化,免疫组化法观察各组大鼠海马区Bax、Caspase-3蛋白表达变化,HE染色法观察各组大鼠海马神经细胞形态变化。结果:1.动态脑电结果:与癫痫模型组相比,灵芝酸处理组的癫痫发作潜伏期延长(P<0.05);癫痫波发放的频率减少(P<0.05)。2.HE染色结果:光镜下可见A组大鼠海马CA1区及CA3区神经元呈多层分布,细胞树突稠密,侧支丰富,B组神经元数目明显减少,较A、C两组海马神经元变性、坏死的数量和程度要重。3.免疫组化结果:与A组相比其余四组中Bax、Caspase-3的表达量相对较高(P<0.01);灵芝酸干预后,C、D、E组中Bax、Caspase-3的表达量明显比B组降低(P<0.01)。D、E两组中Bax、Caspase-3的表达量比C组高(P<0.05),D、E两组中Bax、Caspase-3的表达量无明显差异(P>0.05)。结论:1.灵芝酸对癫痫大鼠海马神经元具有一定保护作用,且其最适浓度为12.5mg/kg。2.灵芝酸可通过影响bax、caspase-3的表达量抑制凋亡的发生,对癫痫大鼠海马神经元起到保护作用。3.灵芝酸可能通过延长癫痫大鼠的癫痫发作潜伏期、降低痫性波发放频率从而抑制癫痫发作,减少海马神经元的损伤。第二部分:pi3k/akt通路在癫痫中的作用及其机制目的:观察灵芝酸对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元p-akt、akt、bcl-2蛋白表达的影响,及大鼠认知功能的改变,并通过应用wortmannin阻断pi3k/akt通路,探讨灵芝酸抗癫痫的作用机制。方法:抽取雄性sd大鼠80只,随机分为5组,a、b、c三组每组20只,d、e两组每组10只,a组:对照组,给予生理盐水腹腔注射。b组:癫痫模型组,给予锂-匹鲁卡品腹腔注射后造成大鼠快速癫痫模型,并给予生理盐水替代灵芝酸腹腔注射。c组:灵芝酸干预组,于造模前30min给予灵芝酸腹腔注射。d组:wortmannin抑制剂组,于造模前60min给予腹腔注射wortmannin,造模前30min注射生理盐水。e组:二甲基亚砜(dmso)对照组,于造模前60min给予腹腔注射dmso,造模前30min注射灵芝酸。各组给药后,观察大鼠发作程度及行为变化,免疫荧光法观察各组大鼠海马区akt、p-akt、bcl-2蛋白的表达变化,水迷宫实验观察各组大鼠认知功能改变。结果:1.免疫荧光结果:与a组相比其余四组中p-akt、akt、bcl-2的表达量相对较高(p<0.01);b组与c、d、e组相比,p-akt、akt、bcl-2的表达量降低(p<0.05);d组与c、e组相比,p-akt、akt、bcl-2的表达量相对较低(p<0.05)。c组与e组相比较,p-akt、akt、bcl-2的表达量略有高(p>0.05)。2.水迷宫检测结果:迷宫实验训练3天后,各组大鼠寻找平台的潜伏期均逐渐缩短(p<0.05)。灵芝酸处理组较癫痫模型组的潜伏期明显缩短(p<0.05)。空间探索试验中,癫痫模型组大鼠的穿台次数明显较对照组减低(p<0.05),在目标象限停留的时间也明显缩短(p<0.05);灵芝酸处理组大鼠穿过平台的次数较癫痫模型组有所增加(p<0.05),在目标象限停留时间也明显延长(p<0.05)。结论:1.灵芝酸可有效改善癫痫大鼠的认知功能障碍,并且其机制与PI3K/Akt通路的活化并影响其下游蛋白的表达有关。2.PI3K/Akt通路参与了癫痫的发生、发展。