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目的：利用膜片钳技术研究吗啡后处理对缺血心肌细胞膜ATP敏感性钾通道的影响；探讨吗啡后处理可能涉及的阿片受体亚型。
方法：用胶原酶急性分离大鼠心肌细胞,将分离的心肌细胞置于浴液,细胞静止附着于玻片,在全细胞记录模式下,向浴液中以Bolus方式加入氰化钠(NaCN),使其终浓度为2mM,以此模拟细胞缺血。步阶刺激方案为:牵制电位-40mV,测试电位从-110mV至+50mV,间隔10mV,持续时间100ms。ATP敏感性钾通道电流(IKATP)的记录方案为:测试电位从-40mV至0mV,持续时间100ms,每15s一次,取测试电位结束时的电流强度做分析。数据采集软件为pclamp9.2,数据分析软件为clampfit9.2(Axon Instruments,USA)和ORIGIN7.5(OriginLab Corpration,USA)。实验分组:(1)正常心肌细胞Morphine组:形成全细胞记录模式后,先以含吗啡的浴液灌流10min,再加入NaCN,研究吗啡对正常心肌细胞KATP通道是否有影响；(2)对照组:形成全细胞记录模式后,向浴液加入NaCN,当电流出现并达最大值时加入ATP敏感性钾通道(KATP)特异性阻断剂Glibenclamide以验证电流是否为ATP敏感性钾通道电流(IKATP)；(3)缺血对照组:形成全细胞记录模式后,向浴液加入NaCN,观察电流出现直至消失的电流变化过程；(4)缺血心肌细胞Morphine组；(5)缺血心肌细胞Naloxone+Morphine组(NAL+Morphine组)；(6)缺血心肌细胞Naltrindole+Morphine组(NTD+Morphine组)；(7)缺血心肌细胞Nor-binaltorphimine+Morphine组(nor-BNl+Morphine组)。(4)～(7)各组均为形成全细胞记录模式后,向浴液加入NaCN,待电流出现并稳定后再加入相应试剂,观察电流变化,最后均加入Glibenclamide(0.5μM)以验证电流是否为IKATP。
结果：
1.吗啡对正常心肌细胞KATP通道无影响。正常心肌细胞Morphine组用含3μM吗啡的浴液持续灌流心肌细胞10min,期间未见IKATP出现,吗啡不能激活正常心肌细胞KATP通道。当将吗啡洗脱,向浴液加入NaCN(2mM)时,则可观察到IKATP出现(用Glibenclamide验证),可见心肌细胞膜存在KATP通道(n=8)。
2.对照组形成全细胞记录模式后,向浴液加入NaCN,心肌细胞平均5±2min开始出现电流,待电流达最大值时加入Glibenclamide,可见电流迅速降低接近基础水平,说明该电流为IKATP,以此证明NaCN可激活心肌细胞KATP通道(n=8).
3.缺血对照组形成全细胞记录模式后,向浴液加入NaCN,心肌细胞平均5±2min开始出现电流,渐至最大值,然后缓慢下降直至基础值,期间未见电流回升现象(n=8)。
4.缺血心肌细胞Morphine组形成全细胞记录模式后,向浴液加入NaCN,待电流出现并稳定后加入3μM吗啡可观察到电流增加61.4±13.6％(p<0.01,n=6)。
5.nor-BNI+Morphine组形成全细胞记录模式后,向浴液加入NaCN,待电流出现并稳定后先加入κ-阿片受体特异性阻断剂Nor-binaltorphimine(5μM)观察至少5min未见电流增大,随后加入Morphine(3μM)可观察到电流增加86.0±10.5％(p<0.01,n=6)。
6.NAL+Morphine组和NTD+Morphine组形成全细胞记录模式后,向浴液加入NaCN,待电流出现并稳定后先分别加入非特异性阿片受体阻断剂Naloxone(10μM)与特异性6.阿片受体阻断剂Naltrindole(5μM),观察至少5min未见电流增大,随后加入Morphine(3μM)观察至少10min仍未见电流增加(每组n=6)。
结论：
1.吗啡后处理可促进缺血心肌细胞膜KATP通道开放,使IKATP增加；
2.吗啡后处理促进缺血心肌细胞膜KATP通道开放是通过激活心肌细胞膜δ-阿片受体所致。