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嵌合抗原受体 T 细胞治疗(Chimeric antigen receptor T cell therapy,CAR-T therapy)是一种新兴的肿瘤免疫治疗,该疗法是通过对患者体内的T细胞进行改造,在T细胞膜上表达一种肿瘤特异性的嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptors,CARs),使其能够通过肿瘤特异性的、非MHC分子依赖性的途径激活,从而发挥抗肿瘤作用。CAR是一种跨膜受体,主要由胞外识别结构域、跨膜区和胞内激活结构域组成,其胞外识别结构域通常为肿瘤细胞特征性表面分子的单链抗体(single~chain variable fragment,scFv),胞内激活结构域为T细胞受体(T cell receptor,TCR)的CD3zeta片段,当CAR胞外的单链抗体与肿瘤细胞识别、结合,即可激活CD3zeta,进而直接激活T细胞。至今已发展出三代CAR,其中第二代CAR是研究最多、最具应用前景的CAR,第二代CAR分子在跨膜区和激活结构域之间还偶联了一个T细胞共刺激分子,如CD28、4-1BB等,在共刺激分子的协同作用下,CAR-T细胞表现出更持久的增殖能力和更强的抗肿瘤功能。另外,有研究指出,在CAR分子上偶联某种细胞因子如IL-15,使细胞因子与CAR共表达于T细胞,也能显著提高T细胞的体内、体外生存和杀伤靶细胞的能力。细胞因子IL-18和IL-21是两种具有抗肿瘤活性的蛋白质,IL~18可作用于T、B以及NK细胞,增强他们的抗肿瘤功能,而IL~21可作用于CD8+ T细胞,参与调控其增殖、分化和激活,已有研究将外源性IL~18和IL-21用于辅助肿瘤治疗,并取得了良好的效果。本研究以靶向CD19分子的第二代CAR为基础,提出了两种"细胞因子共表达型CAR"的设计方案:共表达IL-18的CAR和共表达IL-21的CAR。通过基因工程相关技术,我们分别获得了 αCD19scFv、4-1BB~CD3zeta、IL-18和IL-21基因片段,将其拼接并插入到慢病毒载体pLVX-CMV-IRES-ZsGreen相应的酶切位点中,构建出可表达目的基因的三种重组质粒:pLVX-CAR19、pLVX-CAR19-IL-18和pLVX-CAR19-IL-21。利用三质粒慢病毒包装系统,我们制备得到了具有较高感染能力的三种重组慢病毒V-CAR19、V-CAR19-IL-18、V-CAR19-IL-21。随后,为了研究这两种"细胞因子共表达型CAR"的功能,我们将慢病毒感染Jurkat细胞,以Jurkat细胞为模型,制备出三种JurCAR-T细胞:JurCAR19、JurCAR19-IL-18、JurCAR19-IL-21,为后期研究做准备。本研究构建的两种CAR-T细胞,其偶联的细胞因子IL-18和IL-21可在T细胞内持续性表达。首先,我们其生物学特性进行了检测,结果显示,JurCAR19-IL-18和JurCAR19-IL-21分别高表达IL-18和IL-21,表明细胞因子型JurCAR-T细胞构建成功;检测胞内IFN-γ mRNA水平发现共表达IL-18或IL-21并不会对未激活T细胞的IFN-γ表达造成影响,表现出一定的安全性;而增殖实验结果表明,共表达IL-18或IL-21均可促进未激活T细胞的体外增殖,其中IL-21的作用更显著。以上结果表明,共表达IL-18或IL-21的CAR-T细胞其体外增殖能力增强的同时,还保持一定的安全性。随后,我们检测了各组JurCAR-T细胞的抗肿瘤能力,结果发现,共表达IL-18或IL-21后,JurCAR-T细胞杀伤CD19+靶细胞的能力显著增强,同时也检测到JurCAR-T细胞CD69表达显著上调、增殖能力明显增强,提示JurCAR19-IL-18和JurCAR19-IL-21具有低毒、强效等优点。为了验证上述结果,我们还从脐带血中分离出淋巴细胞,并感染的得到了CAR-T 细胞:CAR19-T、CAR19-IL-18-T、CAR19-IL-21-T,共培养实验得到了与JurCAR-T同样的结果,即相比CAR19-T细胞,细胞因子表达型CAR19-IL-18-T、CAR19-IL-21-T细胞活化水平更高、体外增殖能力更强,并具有更强的杀伤肿瘤靶细胞的能力。综上所述,本研究构建的两种细胞因子表达型CAR-T细胞CAR19-IL-18-T和CAR19-IL-21-T,激活前和激活后均表现出更强的体外增殖能力,有利于CAR-T细胞的体外扩增;经靶细胞刺激活化后,两种CAR-T细胞也表现出更高的活化水平和更强的抗肿瘤功能。本研究提出了两种新的CAR-T细胞设计方案,并初步验证了其体外功能,为其体内功能的检测奠定了基础,也为CAR-T治疗的临床应用提供了新方案。