论文部分内容阅读
烟草普通花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是Togaviridae科Tobamovirus组的单链RNA(signal strand RNA,ssRNA)病毒,可侵染包括茄科植物在内的350多种植物。烟草是茄科植物中具有特殊地位的经济作物,敏感烟草感染TMV后可引起30-50%损失,严重的甚至绝收。据统计,全世界每年仅因TMV危害造成的损失就高达1亿美元,而TMV在我国吉林、河南、山东、贵州、云南等省的烟草种植区均有发生,田间发病率一般在5-20%。贵州作为全国的第二大烤烟种植大省,广泛种植有南江3号、贵烟4号、云烟87、K326、云烟97等重要的烤烟品种。其中,仅K326品种在2012年的种植面积就近1.22万公顷,占贵州烤烟总种植面积的33.8%,但该品种易感TMV,可造成极大的损失,据统计贵州每年因TMV造成的损失就高达0.32亿元。利用TMV抗性基因(resistance gene)进行抗性育种是最为经济、安全、长效的方法之一。本研究以黄花烟(N.rustica L.)来源的抗性CN作为抗源,构建了3个含CN基因的植物表达载体pSH-CN,pGM626-DL-SAF-UCn和pSH737-U4Cn-RcHak并分别对K326进行遗传转化,对筛选获得的转基因植株进行人工接种TMV,分析转基因植株应答TMV侵染后的表现和探讨CN基因介导的抗病机理。主要获得如下结果:1.转CN基因烟草接种TMV后引起了接种叶片产生超敏反应(hypersensitive,HR),降低了脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,延缓了由于TMV繁殖扩散所引起的花叶斑形成和叶绿素含量下降,表明CN基因的导入可诱导机体产生HR,在接种叶片形成坏死斑(necrosis spots),从而限制病毒的扩散,延缓病毒引起的植株系统感染;同时,转基因植株应答TMV感染时,可显著降低MDA含量,更好地保护植物细胞免遭质膜过氧化产物的损害,提高植株细胞对病原菌的防御能力;另外,CN基因的导入引起了植株产生了系统超敏反应(systemic hypersensitive,SHR),SHR的发生亦可提高植株对其它入侵病原菌的系统抗性;2.接种TMV后,转基因植株中的抗氧化酶(antioxidant enzymes,AOEs),包括超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod),过氧化物酶(peroxidase,pod)和过氧化酶(catalase)的酶活性均显著增加,说明转基因植株在防卫tmv侵染时可通过显著提高aoes活性来实现自身对入侵病毒的抵抗力。aoes活性高低一般认为与机体内活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)的含量正相关,植物体受到生物或非生物胁迫时通常可引起其体内ros的迅速增加,而高ros含量会严重导致细胞受损。因此,转基因植株接种tmv后一方面通过提高aoes活性使植物细胞免遭ros的氧化损伤,保护其完整性,提高植物组织对病原菌的防卫能力,一方面高的aoes活性对于调节以抗性基因介导的抗病应答通路启动也十分重要;3.转基因植株在接种tmv后引起了植物体内过氧化氢(hydrogenperoxide)和水杨酸(salicylicacid,sa)含量的显著增加,两者在抗性基因(resistancegene,r)介导的抗病应答信号通路中作为信号分子调控或激活下游抗病基因的表达。h2o2的积累与aoes活性增加有关,病原菌的侵入后导致植物体o·2-迅速增加,sod可催化o·2-形成h2o2,进而减小由于o·2-的过剩积累所引起的组织氧化损伤;h2o2可作为pod和cat的底物被进一步代谢,前者主要利用h2o2氧化多种底物,如酚类,乙醇和甲醛等,起到毒害物质(h2o2)脱毒的作用;后者可直接将催化h2o2形成h2o。tmv接种初期,cn基因显著提高了转基因植株中aoes的活性;接种后期,转cn基因植株又显著降低了cat酶活性,cat酶活性的降低引起了h2o2含量增,后者在植物产生hr和系统获得抗性(systemicacquiredresistance,sar)中起到重要作用。tmv接种引起转基因植株sa含量的显著增加,而sa又可作为内源信号分子调控植株的抗病应答机制启动,已有研究表明sa可结合于病程相关蛋白基因pr-1a启动子序列的类as-1调控区,从而启动该基因表达提高植株对病原菌的防御能力;4.tmv接种后,cn基因诱导了抗病应答信号通路中蛋白组分,如cn(n-likeprotein)、rar1(requiredformla12resistance)、stg1(suppressorofg2alleleofskp1)、mek1(mitogen-activatedproteinkinasekinase)、ntf6(mitogen-activatedproteinkinase)、pr-1a(pathogenesis-relatedproteins1a),和转录因子wrky1表达量的显著上调。一般认为,病原菌入侵后其无毒基因(avirulence,avr)编码产物可与植物体内r基因编码的产物以―r-avr‖的方式形成复合物,进而调控下游抗病相关基因的表达的转录激活。转基因植株接种tmv后,引起了cn基因表达量的显著上调,说明tmv入侵诱导tmv-avr-cn复合蛋白的形成,之后蛋白组分RAR1和STG1的表达量也显著增加,表明Avr-CN复合蛋白可进一步与STG1和RAR1结合形成原初―病原菌-宿主‖复合蛋白调控下游抗病基因的表达。在STG1和RAR1表达量上调之后,其他蛋白组分NTF6、MEK1和转录因子的表达量也随之增加,说明该复合蛋白在激酶磷酸化作用经由促分裂原活化蛋白激酶级联途径信号通路(mitogen-activated protein kinase cascades,MAPK cascades)调控下游PRs的表达,从而实现转基因植株对TMV的控制;5.本研究通过植物表达载体pGM626-DL-SAF-UCn对烟草进行遗传转化,分析外源基因,包括筛选报告基因Bar::GUS、重组酶(recombinase)基因FLP和抗病基因CN在转基因烟草植株中的清除情况。随着转基因烟草叶片逐渐衰老成熟,烟叶对除草剂草铵膦(phosphinothricin,PPT)敏感性逐渐增加,对GUS(β-glucuronidase)染色活性逐渐下降,说明转基因烟草植株中―Gene-deletor system‖实现了包括Bar::GUS,FLP和CN在内的所有外源基因的清除。―Gene-deletor‖技术的应用为创制培育无选择标记、抗病烟草新种质提供理论基础;6.利用pSH737-U4Cn-RcHak对烟草K326进行遗传转化不仅通过CN基因介导的抗病应答机制提高转基因烟草植株对TMV的抗性,而且烟草高亲和钾离子转运蛋白(high-affinity potassium transport,HAK)的共同导入增加了转基因植株的叶片厚度,减小了接种叶抗病斑的大小。说明CN和HAK的协同表达不仅提高了转基因植株对TMV的内部防御(CN介导的抗病调控),同时也增强植株对TMV的体外防御(叶片加厚)。同时,转基因烟草中HAK的超量表达还同时提高了植株对盐胁迫(salt stress)的耐受力,而非生物胁迫对会显著降低植株应对生物胁迫的能力,超量表达HAK提高了转基因烟草植株的钾素营养富集能力及增强其光合作用,同时还可增加烟草植株对盐胁迫的抵抗力。以上研究表明,通过分别含2个质粒的2种工程农杆菌介导的共转化法对烟草进行遗传转化可筛选获得无选择标记、富钾能力强且耐盐的抗病烟草新种质提供参考。