脑发育和损伤的关系日益受到人们的重视,一方面,一些发育相关基因参与了脑损伤、再生的病理、生理过程,另一方面在发育期间高表达的许多有利于轴突生长、突触形成以及一些调节神经细胞分化、迁移的基因,可适当的通过基因工程技术应用到再生中去将有助于脑损伤的修复。脑功能和结构的复杂性,其分子基础是基因表达的复杂性,任何一个脑发育或者损伤事件的分子机制,往往牵涉到多个基因的表达改变。基因芯片技术提供了一个可以同时研究多个基因动态改变的分子生物学平台,上万个基因的改变情况在一次芯片实验中同时被展示出来。本研究以处于视神经发育关键时期的出生前后的小鼠作为发育模型,以左侧眼球摘除作为视神经损伤模型,以正常成年小鼠作为对照,采用高密度发育 cDNA 基因芯片检测、分析了处于视神经发育、损伤不同时期的视神经的第一级投射站——外侧膝状体的发育、损伤相关基因的表达情况,有如下主要发现:一、脑损伤、发育模型的建立:1. 采用小鼠左侧眼球摘除作为视神经损伤的模型,出生前后的小鼠作为视神经发育的模型,出生后 35-60d 的正常小鼠作为对照。2. 采用 GFAP 免疫组化染色观察了小鼠双侧的外侧膝状体在 E15、E18、P0、P7、C、I1、I7、I14、I21 的星型胶质细胞的变化情况,结果发现胚胎时期 LGN 区域未见GFAP 阳性着色细胞,P0 开始出现少量着色较浅、体积较小、以单突起为主的 GFAP阳性细胞。损伤后 I1 即出现显著的 GFAP 反应,I7 达到高峰,而后逐渐下降,I21 基本下降至正常水平。双侧对比无显著差异。3. 采用焦油紫染色显示双侧 LGN 的神经元的变化情况,发现神经元从胚胎到成年经历一个形态学以及数量的变化:细胞体积由小变大,着色由浅到深,尼氏体由模糊到清晰,而细胞数量由多变少,损伤组和成年对照差别不大。4. 采用常规电镜观察了上述各发育、正常对照、损伤时期的 LGN 的超微结构的变化情况,结果发现:出生前 LGN 区域的神经纤维只有少量的无髓神经纤维,未见有髓神经纤维,P0 开始出现有髓神经纤维,无髓神经纤维的数量增多而且排列更加规 6<WP=11>第三军医大学博士学位论文则。损伤后各期可见崩解的有髓神经纤维。5. 从这些形态学的改变来看,出生前后 LGN 的神经元、胶质细胞、神经纤维都在经历一个快速的发育变化当中以适应该时期视觉的快速发育,眼球摘除后 LGN 也在发生着剧烈的反应,这些时期的外侧膝状体是用来来研究视神经发育、损伤相关基因的很好的材料。而且本研究使用的动物模型操作简单、动物的存活率高、取材方便,更重要的是手术的重复性好、能尽量减少非处理因素的干扰,是一个研究脑发育、损伤的很好的动物模型。二、高密度基因芯片筛选脑发育、损伤相关基因结果:1. 采用改良的两次萃取法提取 LGN 组织的总 RNA,获得的总 RNA 有较高的纯度,多数不需要进一步的纯化,可以直接用于基因芯片的杂交。2. 采用高密度发育表达谱基因芯片,检测了在视神经发育、损伤共 8 个不同的时相点上 LGN 的基因表达情况,共找到差异表达基因 2041 个:高表达的基因 1095 个(Ratio≥2),其中在发育期间高表达的基因 560 个,在损伤后高表达的基因 416 个,在发育期间和损伤后均有高表达的基因 119 个;低表达的基因 946 个(Ratio≤0.5),在发育期间低表达的基因 275 个,在损伤后低表达的基因 458 个,在发育及损伤后均低表达的 213 个。在损伤和发育过程中无差异表达的基因共 1563 个(2>Ratio>0.5)。3. 对差异表达基因以 Blot1808(Rp15 基因)为代表,采用 RT-PCR 技术对其芯片实验结果进行了验证,RT-PCT 的结果和基因芯片结果基本一致。4. 对高表达的 1095 个基因进行了功能检索、分组,其中 51.19%的基因的功能完全未知,其余功能已知或者部分已知的基因共分为转录调节、信号转导、蛋白质合成、物质转运、RNA 加工、代谢相关、细胞周期或者凋亡相关、细胞外基质、蛋白质的折叠与降解、细胞骨架、组蛋白代谢、神经系统特异性功能基因、肿瘤相关基因、DNA复制修复、轴突生长诱导、免疫反应、细胞粘附分子等 17 组,其中在发育阶段数量最多的功能组是转录调节组和信号转导组,在损伤过程数量最多的功能组是代谢组和物质转运组。5. 一些和轴突生长、导向、突触形成相关的基因 Efnb3、Ptn、Nrp、Dbn1 只在发育期间高表达,抑制轴突生长的基因 Rtn4(Nogo A)只在损伤后高表达,一个和神经元的迁移、轴突的生长相关的基因——Mdk 在发育和损伤过程中均有高表达,这些基因可能是视神经发育以及损伤、修复过程中起关键作用的基因。6. 49 个过度表达基因(Ratio≥7)在本研究中被发现,其中在损伤期间过度表达的基因 15 个,在发育期间过度表达的基因 34 个。从功能分类来看,损伤后过度表达基 7<WP=12>第三军医大学博士学位论文因多数是蛋白质合成、转运、代谢相关的基因,而发育过程中过度表达的基因则和转录调控、信号转导、细胞周期、轴突生长、髓鞘形成等密切相关。三、基因芯片数据的分层聚类分析结果:1. 对符合筛选条件的 1033 个基因进行了分层聚类,根据分层聚类的树形图,分为 A、B、C?