polyQ疾病是一类常见的神经系统遗传变性性疾病，其发生主要是由疾病基因编码区CAG三核苷酸重复扩展突变导致相应基因所编码的蛋白质产生polyQ扩展突变所致。截至目前，已发现的polyQ疾病至少有九种，分别是SCA1、2、3、6、7、17型、HD、DRPLA以及SBMA。polyQ疾病的主要病理学标志是病变受累神经元内形成核内或胞浆包涵体，在polyQ疾病的细胞模型中则表现为核内或胞浆蛋白聚合体的形成。polyQ疾病的发病机制目前并未完全阐明，但polyQ扩展突变导致polyQ蛋白获得细胞毒性是其致病的关键这点已取得大家的共识：突变的polyQ蛋白单体或由其所形成的蛋白聚合体可能通过损害泛素-蛋白酶体通路、抑制转录、激活caspase以及产生线粒体毒性等机制而致病。SUMO-1是一种与泛素同源的小分子修饰蛋白，但与泛素修饰底物蛋白主要导致底物蛋白被蛋白酶体降解不同的是：底物蛋白苏素化(sumoylation)主要与底物蛋白的亚细胞定位、蛋白质稳定性、底物蛋白生理功能的调节等密切相关，已有研究表明SUMO-1修饰某些扩展突变的polyQ蛋白可使其细胞毒性增加。ataxin-3是SCA3/MJD致病基因MJD1编码的polyQ蛋白，与其它多数polyQ蛋白一样，ataxin-3的正常生理功能以及其polyQ扩展突变后如何致病目前并不完全清楚，关于ataxin-3与SUMO-1的关系目前也没有研究报道。我们在前期研究中通过酵母双杂交发现并已经在酵母中证明SUMO-1是ataxin-3的互作蛋白，进一步在哺乳动物细胞中明确SUMO-1是否修饰ataxin-3以及这种修饰可能具有的病理生理学意义无疑将有助于阐明ataxin-3的正常生理功能以及SCA3/MJD乃至其它polyQ疾病的发病机制。 在本实验中，我们首先成功构建了SUMO-1、野生型以及polyQ扩展突变型ataxin-3的真核表达质粒pCDNA3.1/Hygro(-)-SUMO-1、pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD20Q、pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD68Q。三个质粒单独转入体外培养的SH-SY5Y细胞后，相应蛋白质的表达均通过Western印迹和免疫荧光得以验证：转染了pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD20Q和pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD68Q的细胞分别成功地表达了分子量约为50kD和60kD的ataxin-3-20Q-c-Myc和ataxin-3-68Q-c-Myc；ataxin-3-20Q-c-Myc均匀分布于胞浆和胞核，ataxin-3-68Q-c-Myc虽在多数细胞也均匀分布于胞浆和胞核，但在部分细胞的核内可形成蛋白聚合体；转染了质粒pCDNA3.1/Hygro(-)-SUMO-1的细胞表达的SUMO-1主要有17kD的游离形式和90kD的结合形式两种存在形式，而内源性SUMO-1绝大多数以90kD的结合形式存在，内源性和外源性的SUMO-1均主要以斑点状形式分布于核内。 转染pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD20Q和pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD68Q的细胞中用c-Myc抗体除检测到50kD和60kD的ataxin-3-c-Myc蛋白主带外，另外还检测到两条弱的比ataxin-3-c-Myc蛋白主带分子量高的蛋白质条带，其中一条比ataxin-3-c-Myc蛋白主带分子量高了约17kD，恰好与SUMO-1修饰底物蛋白所产生的蛋白质表观分子量变化一致，高度提示ataxin-3可能被SUMO-1修饰。生物信息学分析也显示ataxin-3的氨基酸序列中存在一个高度可能的苏素化位点。进一步我们综合利用免疫荧光和免疫共沉淀实验证实了ataxin-3的确是SUMO-1的底物蛋白之一：免疫荧光结果显示：polyQ扩展突变型ataxin-3所形成的核内蛋白聚合体以及野生型ataxin-3均与SUMO-1在细胞核内形成的斑点状分布重叠；在单转ataxin-3表达载体和共转ataxin-3与SUMO-1表达载体的两组细胞，其全细胞裂解液用c-Myc抗体免疫沉淀后用SUMO-1抗体免疫印迹或者用SUMO-1抗体免疫沉淀后用c-Myc抗体免疫印迹均可检测到一条比ataxin-3主带分子量高17kD的蛋白条带-即苏素化的ataxin-3。突变ataxin-3在全身各组织广泛表达但SCA3/MJD却只选择性累及神经系统。神经元所处的特定的细胞周期-静止期可能与神经元对突变ataxin-3的细胞毒性特别敏感有关，对体外培养细胞采取血清饥饿处理使其同步在G0/G1期可能能更客观地模拟SCA3/MJD的发病过程。鉴于此，在研究ataxin-3苏素化的病理生理学意义时，我们对细胞分别采取正常血清培养和血清饥饿两种处理。对SUMO-1则采取过表达以及利用RNA干扰技术下调其表达两种处理方式。转染了ataxin-3表达质粒的细胞经上述各相应处理后，在激光共聚焦显微镜下计数有核内蛋白聚合体形成的细胞数并运用MTT法检测细胞活性。结果：单转pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD68Q的细胞，血清饥饿处理组与正常血清培养组比较，有核内蛋白聚合体形成的细胞数增加而细胞活性下降，组间差异有统计学意义；与单转pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD68Q的细胞比较，共转SUMO-1表达载体可使有核内蛋白聚合体形成的细胞数目增多而细胞活性下降，共转SUMO-1的RNA干扰载体可使有核内蛋白聚合体形成的细胞数目减少而细胞活性上升。但是，这种由SUMO-1的表达差异所带来的有核内蛋白聚合体形成的细胞数目以及细胞活性的改变，只有在血清饥饿处理组才有统计学意义，在正常血清培养组并无统计学意义。上述结果表明苏素化后突变型ataxin-3形成核内蛋白聚合体的趋势及其对细胞生长的抑制作用都有所增加，细胞处于静止期可使突变型ataxin-3苏素化的这种效应更加明显。