天然产物特别是植物中的次生代谢产物是人类预防和治疗疾病药物的重要来源,也是新农药创制的重要资源。天然香豆素类化合物作为一大类植物次生代谢产物,其主要结构类型有简单香豆素、呋喃香豆素(分为线型和角型呋喃香豆素)、吡喃香豆素(分为线型和角型吡喃香豆素)五种类型。某些天然香豆素化合物具有杀虫、抑制植物病原菌及抗炎的活性,自然界蕴藏的天然香豆素种类繁多,为了进一步开发新的天然香豆素类化合物在杀虫、抑菌和抗炎方面上的应用,本研究通过从6种具有杀虫抑菌抗炎活性的植物中提取分离及利用合成的方法得到五种类型香豆素化合物,研究这些化合物的杀虫、抑菌和抗炎活性,筛选活性较好的化合物,并探索活性化合物的作用机制,为活性化合物的应用开发提供理论依据;同时通过研究活性化合物结构类似物的合成方法和活性,为开发应用香豆素类生物农药提供合成方法上的参考。1.植物中天然香豆素化合物的分离鉴定为了筛选得到杀虫、抑菌和抗炎活性较好的天然香豆素类化合物,本文从6种具有杀虫抑菌抗炎活性的植物中提取分离鉴定了 32种化合物,其中有22种为香豆素化合物,涵盖5种不同类型。具体为:从白芷Angelicadahurica中鉴定得到6种线型呋喃香豆素化合物异欧前胡素、欧前胡素、佛手柑内酯、珊瑚莱内酯、氧化前胡素、水合氧化前胡素;从青海当归Angelicanitida中鉴定得到9种线型呋喃香豆素化合物欧前胡素、别欧前胡素、pabularinone、neobyakangelicol、白当归素、异欧前胡素、cnidilin、珊瑚莱内酯、isopimpinellin;从重齿毛当归Angelica pubescens中鉴定得到6种香豆素化合物分别为 osthol、columbianedin、columbianetin acetate、columbianetin、xanthotexin、umbelliferone;从紫花前胡Peucedanum decursivum中鉴定得到线型呋喃香豆素Nodakenetin 及线型吡喃香豆素化合物 3’-acetoxy-4’-angeloyloxy-3,4-dihydroxanthyletin;从白花前胡P.praerutorum中鉴定得到角型吡喃香豆素化合物白花前胡E素Praeruptorin E 及 3’,4’-disenecioylkhellactone;从九里香 Murraya exotica L.中鉴定得到9种化合物均为黄酮类化合物,未分离到香豆素化合物。2.两种类型香豆素化合物的设计合成植物中的农药活性化合物一般作为新型农药的结构前体,通过化学合成方法改变其取代基来改善其稳定性,并通过提高其农药活性进而开发成新型农药。本文以7-羟基香豆素和蛇床子素为起始原料,通过取代反应、成环反应、环氧化反应、开环反应等方法合成6种吡喃香豆素化合物(其中5种为天然化合物)和8种简单香豆素化合物(其中 6 种为天然化合物),分别为 8,8-dimethyl-2H,8H-pyrano[3,2-g]chromen-2-one、8,8-dimethyl-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-2-one、6,7-dihydroxy-8,8-dimethyl-7,8-dihydro-2H,6H-pyrano[3,2-g]chromen-2-one、9,10-dihydroxy-8,8-dimethyl-9,10-dihydro-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-2-one、8,8-dimethyl-2-oxo-9,10-dihydro-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromene-9,10-diyl diacetate、10-hydroxy-8,8-dimethyl-2-oxo-9,10-dihydro-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-9-yl acetate、Meranzin、Meranzin hydrate、YuehgesinC、Isomeranzin、Auraptenol、Murrayone、7-Methoxy-8-(2’,3’-dibromo)-coumarin、7-Methoxy-8-(2’-hydroxy-3’-bromo)-coumarin,其中化合物 7-Methoxy-8-(2’-hydroxy-3’-bromo)-coumarin 为新化合物。本研究设计合成的香豆素化合物不仅为后续活性化合物的筛选和构效研究提供了更丰富的化合物种类,同时为天然比喃香豆素化合物和简单香豆素化合物的合成提供了新的参考路线和方法。3.五种类型香豆素化合物对粘虫的生物活性随着人们对生存环境的日益重视,开发天然资源物质特别是利用天然植物活性成分,创制新型、高效、低毒杀虫剂倍受人们关注。本文以植物源农药蛇床子素和鱼藤酮为阳性对照采用浸叶法和点滴法测定了 48种供试化合物对粘虫Mythimna separata的生物活性,以期筛选出具有杀虫活性的新型香豆素类化合物。结果显示48种化合物中有20种化合物的拒食活性优于对照蛇床子素(拒食率为46.75%),五种类型香豆素化合物之间拒食活性无明显差异,每种类型都有活性较好的化合物,例如简单香豆素Murrayone(拒食率为77.91%)、线型呋喃香豆素化合物佛手柑内酯bergapten(拒食率为94.30%)、角型呋喃香豆素化合物Columbianadin及Columbianetin(拒食率为82.70%和81.07%)、线型吡喃香豆素化合物Pd-D-V(拒食率为86.65%)和角型吡喃香豆素化合物Disenecioyl Khellactone(拒食率为70.86%)。浸叶法致死结果显示五种类型香豆素化合物中角型呋喃香豆素活性(致死率均大于20%)强于线型呋喃香豆素和角型吡喃豆素化合物(致死率均小于20%),其中简单香豆素化合物Murrayone、角型呋喃香豆素化合物Columbianadin和Columbianetin(致死率均为70.0%)活性相对较高(对照药剂蛇床子素致死率为0)。利用浸叶法进一步测定得到Murrayone、Columbianadin 和 Columbianetin 对 2 龄粘虫的致死中浓度分别为 0.704、0.766、0.801 mg·mL-1。点滴法测定结果同样显示五种类型香豆素化合物中角型呋喃香豆素化合物的致死活性相对较强(20%<死亡率<50%),优于蛇床子素,但明显不如鱼藤酮(致死率100%)。本研究从供试化合物中筛选得到了 4种化合物Murrayone、Pd-D-V、Colunmbianadin和Columbianetin的拒食和致死活性均优于蛇床子素,但尚不如鱼藤酮。4.五种类型香豆素化合物对植物病原菌的抑制活性植物病害是严重危害农作物的自然灾害之一,随着化学农药的长期使用和植物病害耐药性的增强,人们努力地进行新农药的开发,从天然资源宝库中寻找抑菌活性化合物是新农药创制研究的重要领域。本文对五种类型香豆素化合物的抑菌活性进行筛选评估,采用菌丝生长速率法测定了 41种香豆素化合物对植物病原菌(油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌、辣椒炭疽病菌)的活性,结果显示每种类型都有化合物具有较好的抑菌活性,活性和香豆素的类型没有相关性。例如简单香豆素化合物Murrayone(EC50为24.9 μg·mL-1)对辣椒炭疽病菌优于对照药剂蛇床子素(EC50>500 μg·mL-1);线型呋喃香豆素化合物 Imperatorin(EC50 为 21.9 μg·mL-1)对油菜菌核病菌的抑制活性优于对照药剂蛇床子素(EC50>50 μg·mL-1);角型呋喃香豆素化合物Libanorin和CniforinB对油菜菌核病菌、草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌和辣椒炭疽病菌均具有较好的抑制活性(EC50分别为18.8、18.8、25.7、29.5μg.mL-1;26.5、34.5、45.5、32.2μg·mL-1),这两种化合物对油菜菌核病菌和辣椒炭疽病菌的抑制活性优于对照蛇床子素(EC50>50μg·mL-1);线型吡喃香豆素化合物Pd-D-V对植物病原菌油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌和辣椒炭疽病菌的EC50分别为13.2、56.0、35.5、33.5、37.3 μg·mL-1,对油菜菌核病菌和辣椒炭疽病菌的抑制活性优于对照蛇床子素(EC50>50μg·mL-1);角型吡喃香豆素化合物Disenecioyl Khellactone对植物病原菌油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、草莓灰霉病菌和小麦赤霉病菌的EC50分别为29.1、36.2、11.0、40.1 μg mL-1,对油菜菌核病菌和草莓灰霉病菌的抑制活性优于对照蛇床子素(EC50>50、23.5μg·mL-1);合成的6种吡喃香豆素化合物对植物病原菌油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌及草莓灰霉病菌具有较好的抑制活性(EC50在4.7～9.9μg mL-1之间),其活性均优于对照药剂蛇床子素(EC50在7.1～37.2μg mL-1之间)。角型吡喃香豆素化合物对植物病原菌的活性目前尚未见有文献报道,线型吡喃香豆素化合物对植物病原菌活性的研究仅有一篇报道,本研究发现吡喃香豆素化合物具有较好的抑菌活性,揭示了吡喃香豆素化合物在农用杀菌剂研发中的潜在价值。结果还显示有11种天然香豆素化合物对油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌和辣椒炭疽病菌中的某些菌种EC50≤30 μg·mL-1达到了商品生物农药对靶标病原菌活力水平(蛇床子素对白粉病菌的EC50为30.195μg·mL-1),可作为开发新型农药杀菌剂的先导结构化合物。综合比较五种类型香豆素化合物的杀虫抑菌活性测定结果,发现Murrayone、Pd-D-V和Columbianedin不仅杀虫活性高于蛇床子素,并且对某些植物病原菌的抑制活性达到商品生物农药对靶标病原菌的活力水平(EC50≤30μg·mL-1),可作为开发新农药的先导结构化合物。5.供试化合物的抗炎活性炎症是常见疾病,从中药中寻找抗炎免疫活性成分已成为当前抗炎免疫研究的热点。本研究通过观察供试化合物对体外培养的巨噬细胞的毒性及分泌一氧化氮NO的影响,结果显示这几种类型天然香豆素化合物中线型呋喃香豆素化合物的抗炎活性相对较低。测定的其他类型香豆素化合物中,简单香豆素化合物异橙皮内酯Isomeranzin具有较好的抗炎活性且在剂量范围内无细胞毒性;角型呋喃香豆素化合物Cniforin B和角型吡喃香豆素化合物Anomalin虽具有抗炎活性,但两者都有细胞毒性。简单香豆素九里香酮Murrayone的细胞毒性最强,具有潜在的抗癌活性,这一化合物和其他简单香豆素化合物相比,其杀虫抑菌活性相对较强,推测可能和细胞毒性较大有关;九里香酮Murrayone虽抑制巨噬细胞分泌NO的效果较好,然而由于有较强的细胞毒性,本研究从用药安全的角度认为作为中药九里香的药用功效指标不合适。简单香豆素化合物异橙皮内酯Isomeranzin具有较好的抗炎活性且在剂量范围内无细胞毒性,和化合物九里香酮Murrayone结构相似,只是8位取代基3’位取代基不同,九里香酮为双键,异橙皮内酯Isomeranzin为单键,这种结构上的区别造成了其毒性的差异;筛选的简单香豆素化合物中,两者的抗炎活性相对较强,结构上区别于其他化合物的地方在于8位取代基2’位为羰基,可能是其抗炎活性药效活性基团所在。“中药九里香”广泛用于各种炎症性疾病,然而目前其抗炎活性成分不明确,尚未确定功效成分/标志性成分,本研究未分离到目标香豆素化合物,从中分离到多种黄酮类化合物,测定了这些黄酮类化合物的活性筛选到二氢黄酮醇类化合物5,7,3’,4’,5’-五甲氧基二氢黄酮(PMFA)具有较好的抗炎活性且在剂量范围内无细胞毒性,为中药九里香的质量标准中功效成分的制定提供候选化合物的参考。6.化合物Pd-D-V对油菜菌核病菌的毒力及作用方式研究本文研究了线型吡喃香豆素化合物Pd-D-V对油菜菌核病菌菌丝生长的毒力及在菌丝形态与生理生化水平上的毒理反应。结果表明:Pd-D-V对油菜菌核病菌具有较好的抑菌活性(测定的5个不同地方的菌株EC50在7.22-15.23μg·mL-1),优于对照蛇床子素(EC50>37.21 μg·mL-1);Pd-D-V能使油菜菌核病菌菌丝顶端分支增多、扭曲;细胞膜透性增加,可引起细胞内电解质外渗;菌丝体内营养物还原性糖和可溶性蛋白含量显著降低,从而抑制了菌丝生长;几丁质酶活性的升高,使菌体细胞壁主要成分几丁质加速分解,N-乙酰葡萄糖胺含量升高,导致菌体细胞壁结构破坏,从而对菌丝生长产生抑制作用;植物致病因子草酸及胞外多糖含量则显著降低,可使油菜菌核病菌致病力的下降。处理浓度为50 μg·L-1时,在油菜叶部保护和治疗作用的防效分别达到75.21%和97.11%,具有显著的保护和治疗作用,治疗作用更为显著;此外,Pd-D-V在油莱叶片上具有内吸输导性。通过对生理生化特性、保护治疗作用、内吸输导性的测定,为明确Pd-D-V对油菜菌核病菌的作用机制、提高Pd-D-V对油菜菌核病防控效果提供了重要的参考信息,为此化合物进一步在农业上的应用开发提供了理论依据。