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昆虫在觅食、产卵、交配和躲避天敌等活动中,主要利用其复杂的化学感受系统,包括嗅觉和味觉系统,来识别并区分外界环境中的各种化学信息。化学感知过程中,气味结合蛋白(odorant binding protein,OBPs)最先与外界刺激物相互作用,并将其转运至化学受体神经元上,在昆虫与外界进行信息交流的过程中发挥重要作用。中华蜜蜂(Apis cerana cerana Fabricisus)是我国独有的蜂种资源,具有嗅觉灵敏、善于利用零星蜜粉源等西方蜜蜂无法比拟的优点,非常适宜在我国的大部分地区尤其是山林地区饲养。课题组在前期的中华蜜蜂触角转录组的测序分析中,获得1个在工蜂不同发育阶段表达显著上调的气味结合蛋白基因Acer OBP15。本研究拟从分子水平上明确Acer OBP15在嗅觉和味觉感知过程中的作用,从深层次揭示中华蜜蜂的化学感受机制,为问题作物诱导剂的研制提供理论参考。主要研究结果如下:(1)利用q RT-PCR对Acer OBP15基因在越冬期、开繁期和发展期3个阶段的中华蜜蜂各组织(触角、头、胸、腹、足和翅膀)中的m RNA表达谱进行了分析,结果发现Acer OBP15转录本在工蜂触角和足中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。从触角和足在不同阶段的表达模式来看,发展期采集蜂足中的表达量最高,极显著地高于其他两个阶段(P<0.01);越冬期与开繁期间的Acer OBP15表达量无差异(P>0.05);触角中Acer OBP15的表达趋势与足部一致,但三个阶段间的表达量无显著差异(P>0.05)。Western blot分析表明,该蛋白在1、5、10、15、20、25和30日龄中华蜜蜂触角和足中的表达量均存在差异,且在采集蜂的触角和足中高表达。暗示Acer OBP15在中华蜜蜂中除行使嗅觉识别之外还主要参与味觉感知功能。(2)荧光竞争结合试验结果表明,Acer OBP15与荧光探针1-NPN的解离常数为3.318μM。Acer OBP15同报警信息素(2-庚酮和乙酸异戊酯)和那氏信息素(橙花醇和香叶醇)有很强的结合能力;与蜂王信息素(9-ODA和HVA)和幼虫信息素(棕榈酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸乙酯和油酸乙酯)的结合能力很弱。Acer OBP15与大多数植物的花香物质均有较强的结合力,其中与月桂烯的结合力最强(Ki为6.50±0.07μM),进一步表明Acer OBP15在蜂巢外的化学通讯、蜜粉源搜寻与采集过程中发挥功能。(3)触角电生理(EAG)结果显示,中华蜜蜂触角对2-庚酮、乙酸异戊酯和月桂烯的EAG反应最为强烈,均显著高于其他挥发性化合物(P<0.05)。RNAi结果显示,长度为311 bp的ds Acer OBP15饲喂后72 h,中华蜜蜂体内的Acer OBP15 m RNA的沉默效率最高为94.53%,此时触角对2-庚酮和乙酸异戊酯的EAG反应无明显降低(P>0.05),而对月桂烯的EAG反应明显下降(P<0.05),表明Acer OBP15是月桂烯识别过程中的必需蛋白。分子对接分析表明,Acer OBP15的关键结合位点为第91位的苯丙氨酸,能够与月桂烯产生1个H-π共轭键。(4)利用Illumina测序平台分别对RNAi前后的中华蜜蜂头部(含有触角)进行了转录组差异分析,筛选获得1个显著下调的嗅觉受体基因—Acer OR46,推测Acer OR46为Acer OBP15的下游作用基因,可能是月桂烯或其他配体的候选受体。从中华蜜蜂采集蜂触角中克隆获得该基因的开放阅读框(ORF)序列,长为1 221 bp,编码406个氨基酸,无信号肽,含有4个跨膜结构域。Acer OR46 m RNA在哺育蜂和采集蜂的触角中的表达量均为最高,极显著高于头、胸、腹、足和翅膀(P<0.01);采集蜂各组织中的表达量均显著高于哺育蜂相应组织中的表达量,表明Acer OR46在蜜粉源的搜寻和定位过程中发挥重要作用。(5)对1、10和20日龄中华蜜蜂工蜂全足进行转录组测序,筛选获得124个候选的接触性化学感受基因,包括15个气味结合蛋白OBPs、5个化学感受蛋白CSPs、7个味觉受体GRs、2个神经元膜蛋白SNMPs和95个嗅觉受体ORs。FPKM值分析表明,Acer ORs、Acer GRs和Acer SNMPs(除Acer SNMP1)在各日龄足中的表达丰度较低;Acer OBPs和Acer CSPs在各日龄足中的表达水平相对较高且存在显著差异。15个Acer OBPs中,Acer OBP15的表达丰度最高。组织表达模式分析表明,Acer OBP15主要在采集蜂的足中高表达,暗示该基因在味觉识别和蜜粉源选择等活动中发挥重要作用,为蜜蜂采集偏好性分子机制的进一步研究奠定了基础。(6)利用GST pull-down结合LC-MS/MS质谱技术对Acer OBP15的相互作用蛋白进行了鉴定,从中华蜜蜂组织裂解液中共筛选出40个潜在的互作蛋白。GO和KEGG富集分析发现,Acer OBP15互作蛋白主要参与中华蜜蜂体内的碳水化合物、蛋白质和一些小分子物质的代谢过程,推测Acer OBP15可能是多种营养物质的载体蛋白,参与中华蜜蜂体内的多种生物学功能。值得注意的是,我们还发现了TGF-β、Fox O和Wnt 3个信号转导通路,为蜜蜂化学感受机制的深入研究提供新思路。本研究首次发现了Acer OBP15在中华蜜蜂采集过程中发挥双重作用,不仅有对花香物质的嗅觉识别功能,还可以参与足部的味觉感知系统对蜜粉源质量进行检测,为中华蜜蜂的化学感受机制研究奠定理论基础。