论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的高度接触性传染病,给世界各国带来了严重的经济损失。而高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)是PRRS经典毒株的变异毒株,自2006年爆发以来,给养殖场造成的损失更是毁灭性的。因此,建立快捷、敏感的诊断方法对提前预防该疾病,及时采取控制措施具有重要意义。GP5蛋白作为PRRSV病毒的主要结构蛋白,成为血清学检测的重要目标蛋白。巴斯德毕赤酵母作为一种高效表达外源蛋白的真核表达系统,已被广泛应用。本实验将通过毕赤酵母表达系统高效分泌表达去跨膜区的GP5(dGP5)蛋白,并基于该蛋白建立检测GP5蛋白抗体的间接ELISA方法。首先,本研究主要通过密码子的偏嗜性、AT富含区、GC含量调整等对HP-PRRSV HuN4 GP5基因进行优化。在前期研究中,我们将编码同样氨基酸的HuN4野生型GP5基因与优化的GP5基因通过EcoRI和NotI双酶切后,插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中。重组质粒经过SacI线性化后两次电转毕赤酵母菌株GS115中。经过MD板和不同浓度的YPD-G418板筛选出PCR阳性菌株,但发现蛋白均未在毕赤酵母中分泌表达。我们进一步将dGP5基因进行优化并以同样的方法在毕赤酵母中进行分泌表达,成功筛选到高效分泌表达的菌株。为摸索重组蛋白最佳诱导表达条件,我们从不同的方面对dGP5蛋白的表达条件进行优化,如表达时间、甲醇诱导浓度、pH值、温度等。并通过SDS-PAGE和Western-blotting对蛋白进行鉴定。结果表明:优化的dGP5基因在毕赤酵母中成功表达,经过基因优化后,氨基酸序列与优化前一致,修改碱基75 bp,优化后基因与原序列核苷酸同源性为76.9%,涉及62个氨基酸密码子的改变,G+C含量由49.69%变为42.28%。经过外界诱导条件的优化后,确定最佳诱导条件为转速250 r/min,pH为6.5,温度为24℃,甲醇诱导浓度为1%,表达时间为120 h。经过SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,目的带大小为19 KDa左右。其次,通过His柱对蛋白进行纯化并利用纯化好的dGP5蛋白作为包被抗原,进行间接ELISA方法的建立。实验结果表明:抗原最佳包被浓度为0.21μg/孔,4℃过夜。血清最佳稀释度为100倍,作用37℃1 h。酶标抗体进行1:40000倍稀释,作用37℃1 h。与PPV、RV、PRV、CSFV、和TEGV均无交叉反应,具有良好的特异性。批内、批间实验变异系数均小于10%,表明该方法具有良好的重复性。与法国的LSI试剂盒相比,符合率达87%。本研究利用毕赤酵母高效表达dGP5蛋白,并以此蛋白作为包被抗原进行间接ELISA方法的建立。为HP-PRRSV抗体检测,提供一种简便、快捷的诊断方法。