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目的:1.筛选前列腺癌EpCAM特异性核酸适配子Aptamer,验证其对EpCAM阳性的前列腺癌细胞的亲和性。2.将EpCAM特异性Aptamer与活性促凋亡分子tBid共偶联GoldMag金磁纳米微粒,构建分子探针AptamerEpCAM-GoldMag-tBid,验证分子探针对EpCAM阳性前列腺癌细胞的亲和性及靶向促凋亡活性。3.构建前列腺癌荷瘤裸鼠模型,在体内外水平分别验证分子探针AptamerEpCAM-GoldMag-tBid特异性靶向杀伤前列腺癌组织细胞的生物活性及其MR成像能力。方法:1.用流式细胞术和Western Blot分别检测三种人前列腺癌细胞株PC-3、DU145和LNCaP的EpCAM表达水平。2.设计随机单链DNA文库和上、下游引物。将慢病毒表达载体pCDH-EpCAM转染工程细胞人源胚胎肾细胞HEK293T,并以该转染细胞为靶标,利用细胞SELEX技术筛选EpCAM特异性Aptamer,经过12轮体外筛选,对得到的DNA产物行克隆和测序鉴定,最终得到Ep1和Ep2两条DNA序列作为目的Aptamer序列。3.用流式细胞术和细胞免疫荧光实验分别检测Ep1和Ep2对EpCAM阳性的前列腺癌细胞特异性结合的能力。4.利用金磁纳米微粒中金壳的偶联性能,将其分别偶联活性促凋亡分子tBid和前列腺癌特异性EpCAM Aptamer,构建AptamerEpCAM-GoldMag-tBid分子探针（Ep1-GoldMag-tBid和Ep2-GoldMag-tBid）。5.用流式细胞术和细胞免疫荧光实验分别检测分子探针Ep1-GoldMag-tBid和Ep2-GoldMag-tBid对EpCAM阳性的前列腺癌细胞的特异性结合情况。细胞凋亡实验分别检测Ep1-GoldMag-tBid和Ep2-GoldMag-tBid体外杀伤EpCAM阳性前列腺癌细胞的能力。6.将三种前列腺癌细胞株PC-3、DU145和LNCaP分别与Ep1-GoldMag-tBid孵育过夜,经琼脂糖凝胶固定后行MRI扫描,测量比较T2WI图像中各组细胞样品的信号强度。7.将前列腺癌PC-3细胞悬液注入雄性裸鼠前肢腋下脂肪垫处,构建皮下荷瘤裸鼠模型。8.用免疫组织化学染色检测荷瘤裸鼠肿瘤组织及心、肝、脾、肺、肾等重要脏器组织中EpCAM的表达情况。9.将分子探针Ep1-GoldMag-tBid注入荷瘤裸鼠体内,随后分别取其肿瘤组织及心、肝、脾、肺、肾等重要脏器组织制成冰冻组织切片。用组织免疫荧光实验检测分子探针特异性靶向并结合EpCAM阳性的前列腺肿瘤组织的能力。10.将荷瘤裸鼠随机分为三组:高剂量治疗组、低剂量治疗组和PBS对照组。用分子探针Ep1-GoldMag-tBid对荷瘤裸鼠进行治疗,每日观察并记录不同剂量治疗组和PBS对照组裸鼠肿瘤的生长情况,计算肿瘤体积。11.分别取治疗组和PBS对照组荷瘤裸鼠的肿瘤组织和重要脏器组织,制成石蜡组织切片。用HE染色观察分子探针Ep1-GoldMag-tBid对裸鼠正常重要脏器的影响。12.对荷瘤裸鼠行MRI扫描,然后将Ep1-GoldMag-tBid经内眦静脉注入裸鼠体内,在注射后6 h和12 h分别对裸鼠再行MRI扫描,分别测量比较注射前、注射后6 h、注射后12 h荷瘤裸鼠肿瘤组织在T2WI的信号强度。结果:1.用流式细胞术和Western Blot分别检测三种前列腺癌细胞株PC-3、DU145、LNCaP的EpCAM表达水平,结果显示三种前列腺癌细胞和pCDH-EpCAM转染的HEK293T细胞均表达EpCAM分子,而空载体pCDH转染的HEK293T细胞不表达EpCAM分子。2.利用细胞SELEX技术从随机单链DNA文库筛选前列腺癌EpCAM特异性Aptamer,共进行12轮筛选。流式细胞术结果显示,随着筛选次数增加,每一轮DNA产物与pCDH-EpCAM转染的HEK293T细胞结合的荧光强度逐渐增强。将12轮筛选最终所得的DNA产物进行克隆和测序鉴定,最终选取Ep1和Ep2两条DNA序列作为目的Aptamer。3.用流式细胞术和细胞免疫荧光实验分别检测Ep1和Ep2对EpCAM阳性前列腺癌细胞特异性结合的能力,结果显示Ep1和Ep2均能特异性结合并靶向EpCAM阳性的前列腺癌细胞,具有良好的细胞特异性。4.将tBid蛋白和Ep1、Ep2分别偶联金磁纳米微粒,成功构建分子探针Ep1-GoldMag-tBid和Ep2-GoldMag-tBid。用流式细胞术和细胞免疫荧光实验分别检测Ep1-GoldMag-tBid和Ep2-GoldMag-tBid对EpCAM阳性前列腺癌细胞特异性结合的能力,结果显示这两条分子探针均能特异性识别并靶向EpCAM阳性的前列腺癌细胞。细胞凋亡实验分别检测Ep1-GoldMag-tBid和Ep2-GoldMag-tBid体外杀伤EpCAM阳性前列腺癌细胞的能力,结果显示这两条分子探针均能对EpCAM阳性的前列腺癌细胞产生杀伤作用,且Ep1-GoldMag-tBid的杀伤作用较Ep2-GoldMag-tBid更强。5.观察比较分子探针Ep1-GoldMag-tBid对各组前列腺癌细胞的MR特异性成像,结果显示Ep1-GoldMag-tBid可以使EpCAM阳性的前列腺癌细胞在T2WI上信号强度明显减低,而对照组分子探针不能使如上细胞信号强度减低,两组之间的信号强度差异有统计学意义。6.成功构建前列腺癌皮下荷瘤裸鼠模型。用免疫组织化学染色检测荷瘤裸鼠肿瘤组织及心、肝、脾、肺、肾等重要脏器组织中EpCAM的表达情况。结果显示肿瘤组织中EpCAM呈高表达,而心、肝、脾、肺、肾等脏器组织中EpCAM表达不明显。7.用组织免疫荧光实验检测分子探针Ep1-GoldMag-tBid特异性靶向并结合EpCAM阳性的前列腺肿瘤组织的能力,结果显示分子探针可以特异性集聚于荷瘤裸鼠的肿瘤组织,而在心、肝、脾、肺、肾等重要组织脏器中分布不明显。8.用不同剂量的分子探针Ep1-GoldMag-tBid对荷瘤裸鼠进行治疗,观察并记录不同剂量治疗组和PBS对照组荷瘤裸鼠肿瘤的生长情况。结果显示,在治疗期间,PBS对照组荷瘤裸鼠肿瘤呈持续生长;治疗组荷瘤裸鼠肿瘤亦呈持续生长,但生长速度较对照组明显减慢,且高剂量治疗组荷瘤裸鼠肿瘤生长最为缓慢。9.分别取治疗组和PBS对照组裸鼠的肿瘤组织和重要脏器组织。HE染色结果显示经Ep1-GoldMag-tBid治疗后,裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要脏器形态结构完整,未见明显的组织病理学改变。10.对荷瘤裸鼠行MRI扫描,然后将分子探针Ep1-GoldMag-tBid经内眦静脉注入荷瘤裸鼠体内,在注射后6 h和12 h分别对荷瘤裸鼠再行MRI扫描。结果显示注入Ep1-GoldMag-tBid 6 h后,肿瘤组织T2WI信号明显减低,注入12h后肿瘤组织T2WI信号强度略升高,但与注射前相比仍呈明显低信号,而对照组分子探针注射前后T2WI信号强度未见减低,两组间信号强度差异有统计学意义。结论:本课题以高表达EpCAM分子的前列腺癌细胞为靶标,利用细胞SELEX技术筛选EpCAM特异性Aptamer,并将其与人活性促凋亡分子tBid共偶联金磁纳米微粒GoldMag构建分子探针AptamerEpCAM-GoldMag-tBid,从体内外水平分别验证其特异性靶向杀伤前列腺癌组织细胞的生物活性及其MR成像能力。研究证实AptamerEpCAM-GoldMag-tBid不仅能在体外水平特异性靶向杀伤EpCAM阳性的前列腺癌细胞,还能在体特异性亲和EpCAM阳性的前列腺癌组织并具有一定的抑瘤作用,且抑瘤作用存在剂量依赖性。此外,AptamerEpCAM-GoldMag-tBid可以使EpCAM阳性的前列腺癌组织细胞在MR上特异性成像。本课题对EpCAM相关的前列腺癌特异性诊断和靶向性治疗的研究具有重要意义,为其他恶性肿瘤靶向诊治策略的建立奠定理论基础。