金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，随着耐药菌株的增多和耐药性的增强，传统抗生素的治疗效果越来越不尽人意。因此，疫苗研制成为防治该病的关键。研究表明位于S.aureus表面的GapC蛋白具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）活性，该蛋白高度保守，并且具有良好的免疫原性，可以提供良好的免疫保护作用。鞭毛蛋白是近年来发现的一种安全无毒、能够刺激较强细胞免疫应答的新型免疫佐剂，作为Toll样受体5（Toll-like receptor5，TLR5）的配体，鞭毛蛋白与TLR5结合后可诱导天然免疫应答，具有良好的佐剂特性。本研究以大肠杆菌为表达系统，克隆表达鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium,S.typhimurium）鞭毛蛋白，以及鞭毛蛋白与GapC蛋白串联表达的融合蛋白，对其免疫原性及其对S.aureus感染的免疫保护作用进行了初步的研究，探讨鞭毛蛋白的免疫佐剂效应，同时为奶牛乳房炎的防治提供新方法。首先，通过PCR方法扩增鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白Flic基因，随后将其克隆到pMD18-T载体上，测序后与模板序列进行比较分析。再将Flic基因插入pQE30质粒上，并转化至大肠杆菌XL1-Blue中，IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE分析和Western blot检测。其次，通过重叠延伸PCR的方法获得Flic-GapC融合基因，将其克隆到pQE30表达载体上，转化至大肠杆菌XL1-Blue，经IPTG诱导、SDS-PAGE分析和Western blot检测后，纯化表达的重组蛋白，检测融合蛋白的GAPDH活性，进行小鼠免疫试验。同时设Flic蛋白组、GapC蛋白组、GapC蛋白弗氏佐剂组、Flic-GapC蛋白组、Flic蛋白与GapC蛋白联合免疫组以及PBS对照组。将纯化的重组蛋白采用背部皮下注射免疫小鼠，间隔三周免疫两次。二免后3周，用S. aureus Wood46株对免疫小鼠进行攻毒，观察1周并记录结果。与此同时，应用间接ELISA方法检测各实验组血清中抗体水平。二免后2周，分离小鼠脾脏淋巴细胞，进行淋巴细胞增殖实验，利用Elispot方法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的能力。结果，鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白Flic，以及Flic-GapC融合蛋白，在大肠杆菌中正确表达。GapC蛋白弗氏佐剂组、Flic-GapC蛋白组、Flic蛋白与GapC蛋白联合免疫组具有明显的抗体消长曲线，在二次免疫后两周抗体效价达到最高，分别为1：64000、1：64000和1：32000，脾淋巴细胞刺激指数、分泌IFN-γ和IL-4的细胞数与对照组相比，显著升高（p<0.05）。攻毒后一周，这3组的免疫保护率均高于其它各组，保护率分别为80%、70%和60%，而单独的GapC蛋白组保护率仅有20%。证明融合蛋白Flic-GapC可以诱导小鼠产生较好的细胞免疫和体液免疫，免疫效果高于Flic蛋白与GapC蛋白联合免疫组，但低于GapC蛋白弗氏佐剂组。综上所述，以鞭毛蛋白为免疫佐剂，可显著增强GapC蛋白的免疫原性，诱导小鼠产生针对GapC蛋白的特异性抗体，并且刺激了小鼠的细胞免疫应答，显示出鞭毛蛋白良好的免疫佐剂效应。同时，融合蛋白Flic-GapC可在一定程度上抵抗S. aureus的攻击。为研制高效奶牛乳房炎疫苗提供了理论基础。