多肽一般指α-氨基酸以肽键连接形成的化合物,其作为药物具有生物功能明确、作用专一、毒性低等优点,临床上已被广泛用于刺激造血、抗肿瘤、免疫调节等。为克服其稳定性差、半衰期短等缺点,以聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)等聚合物进行化学修饰被认为是简单、有效的策略。考虑到现有化学法修饰多肽药物尚存在反应位点选择性差、修饰率低及易导致活性损失等问题,我们尝试采用酶催化法对多肽药物进行PEG或透明质酸(hyaluronic acid,HA)定点修饰,所采用的工具酶是一种来源于茂源链霉菌(Streptomcyes mobaraensis)的微生物转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase,mTGase)。mTGase可以催化谷氨酰胺(glutamine,Gln)的γ-甲酰胺基和赖氨酸(lysine,Lys)的伯胺基之间形成新的酰胺键。据此,本研究以含Gln或Lys残基的胸腺五肽(thymopentin,TP5;氨基酸序列为RKDVY)、抗肿瘤多肽PCK3145(氨基酸序列为EWQTDNCETCTCYGT)以及设计的抗血管生成活性多肽ES2-TH(氨基酸序列为IVRRADRAAVPGGCGKRK)为研究对象,以末端功能化的PEG或HA为修饰剂,由mTGase催化进行位点特异性修饰;测定得到的PEG/HA-多肽缀合物的药代动力学特征和体外活性,并比较与未修饰多肽的差异。本研究旨在利用mTGase酶催化实现多肽药物的PEG/HA高效、定点修饰。本学位论文的研究内容和取得的主要成果如下:1.PEG-多肽缀合物的酶法合成与表征(1)PEG-ZQG的合成与表征mTGase的二肽底物苄氧羰基-L-谷氨酰胺-甘氨酸(benzyloxycarbonyl-L-glutamine-glycine,ZQG)的羧基经EDC/NHS活化后,与叔丁基胺聚乙二醇胺(BOC-PEG-NH2)的氨基反应得到PEG-ZQG,反应产率为75.3%。紫外-可见扫描谱图显示,PEG-ZQG与ZQG均在255 nm处具有特征吸收峰;PEG-ZQG的1H NMR谱图在δ=7.47-7.17 ppm处新增ZQG苯环的特征信号峰,因此含单一Gln残基的PEG-ZQG的合成成功。(2)PEG-TP5的制备与表征由于TP5含单一 Lys残基,故尝试在mTGase的催化下,使之与PEG-ZQG的Gln残基共价相连。反应液经Superdex30凝胶柱纯化得到产物(命名为PEG-TP5),反应产率为78.5%;HPLC分析表明PEG-TP5的纯度为96.6%。与TP5类似,PEG-TP5的紫外-可见扫描谱图显示其于220 nm和275 nm处具特征吸收峰。其1H NMR谱图在δ=7.02 ppm和δ=6.73 ppm处增加TP5酪氨酸残基中苯环的特征信号峰;在δ = 6.73 ppm处增加了 TP5缬氨酸残基中两个甲基的特征信号峰;与TP5的赖氨酸残基侧链C4-H的信号峰(δ=2.53 ppm)相比,PEG-TP5对应的信号峰向低场移动(δ= 3.18 ppm),表明PEG-ZQG对TP5赖氨酸残基的侧链氨基实现定点修饰。缀合物中TP5的苯环氢信号峰和BOC-PEG-NH2的叔丁基氢信号峰(δ= 1.32 ppm)的积分比为0.41:1,由于每个TP5分子中含有4个芳香氢,每个BOC-PEG-NH2分子中含有9个叔丁基氢,可计算得缀合物的TP5与PEG分子数比为1:1。2.HA-多肽的酶法合成与表征(1)6-O-硫酸化HA的制备与表征HA先以离子交换法转化为四丁基铵盐,再以不同浓度的三氧化硫吡啶络合物对其进行硫酸化修饰,得到不同硫酸化程度的硫酸化HA(sulfated HA,SHA)。元素分析结果显示SHA-1、SHA-2、SHA-3和SHA-4的硫氮原子比分别为0.0500、0.9333、1.453和2.888。其中SHA-2的1H NMR谱图显示位于δ=3.4 ppm的C6-H的信号峰向低场移动,而C2-H、C3-H和C4-H的信号峰未发生明显改变。因此,SHA-2为C6-OH定点硫酸化的HA衍生物。(2)HA-HMD的制备与表征由于HA结构中无游离氨基,采用还原胺化反应于HA末端连接1,6-己二胺(hexamethylene diamine,HMD)。HA-HMD的1H NMR谱图在 δ=1.35 ppm、δ= 1.60 ppm和δ=2.90 ppm处出现三个积分值相近的信号峰,分别为HMD的α-H、β-H和γ-H的信号峰,表明HA-HMD的结构与预期相符。(3)HA-ZQG的制备与表征采用合成PEG-ZQG类似的方法,使HA-HMD的末端氨基与ZQG的羧基共价相连制备HA-ZQG,反应产率为86.9%。HA-ZQG的1H NMR谱图在δ=7.45-7.25 ppm处新增苯环的特征信号峰,表明含Gln的HA-ZQG合成成功。(4)HA-TP5的制备与表征经mTGase酶催化,TP5与HA-ZQG发生修饰反应,纯化得到产物(HA-TP5),反应产率为82.7%,HA-TP5的纯度为95.1%。HA-TP5的1H NMR谱图在δ= 7.02 ppm和δ=6.73 ppm处新增TP5酪氨酸残基中苯环的特征吸收峰;在δ= 3.78 ppm处出现TP5氨基酸的α-H信号峰;在δ=0.99 ppm处出现TP5缬氨酸的甲基信号峰,故TP5被HA共价修饰。缀合物中HA的异头氢信号峰与氨基酸α-H信号峰积分值比例为1:0.29,由于每个TP5分子中含有5个α-H,每个HA分子中平均含18个异头氢,计算得平均一分子HA连接1个TP5。(5)HA-PCK3145的制备与表征在mTGase催化下,尝试以含伯氨基的HA-HMD修饰PCK3145的单一 Gin残基,纯化得到新产物(HA-PCK3145),反应产率为81.7%,纯度为88.3%。HA-PCK3145的1H NMR谱图显示在δ=8.32 ppm处出现PCK3145酪氨酸和色氨酸的苯环特征吸收峰;δ =3.88-3.77 ppm处出现PCK3145各个氨基酸的α-H信号峰,δ= 2.51 ppm处出现谷氨酸残基、谷氨酰胺残基和天冬氨酸残基的特征信号峰,表明PCK3145的Gln残基被HA定点修饰。缀合物中HA的异头氢与氨基酸α-H的氢信号峰积分比例为1:0.8,由于每个PCK3145分子中含有15个α-H,每个HA分子平均含有18个异头氢,可计算得平均一个HA上连接1个PCK3145多肽。(6)HA-ES2-TH的制备与表征以HA-HMD对ES2-TH的Lys进行修饰,纯化得到新产物(HA-ES2-TH),反应产率为85.0%,纯度为92.1%。HA-ES2-TH的1H NMR谱图显示的δ=3.76-3.94 ppm的信号峰归属ES2-TH各个氨基酸α-H;在δ=2.56 ppm处出现峰归属赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸上的与N或S原子直接相连的亚甲基;在δ= 1.21 ppm处出现的峰为异亮氨酸与缬氨酸中甲基的信号峰,表明ES2-TH被HA修饰成功。缀合物中HA的异头氢与ES2-TH氨基酸的α-H信号峰的积分比例为1:1.24,由于每个ES2-TH含有18个α-H,每个HA分子中平均含有18个异头氢,可计算得平均一个HA上连接1个ES2-TH多肽。(7)SHA-ES2-TH的制备与表征最后,以SHA-HMD修饰ES2-TH得到SHA-ES2-TH,反应产率为80.0%,纯度为96.4%。SHA-ES2-TH的1H NMR谱图显示的δ=3.76-3.94 ppm的多个小峰为ES2-TH各个氨基酸α-H的特征信号峰;在δ = 2.56 ppm处出现峰为赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸上的与N或S原子直接相连的亚甲基的信号峰;在δ =1.21 ppm处出现的峰为异亮氨酸与缬氨酸中甲基的信号峰。缀合物中SHA的异头氢与ES2-TH氨基酸α-H信号峰的积分比例为1:1.18,由于每个ES2-TH分子中含有18个α-H,每个SHA分子中平均含有18个异头氢,可计算得平均一个SHA上连接1个ES2-TH多肽。3.多肽缀合物药代动力学研究选用BALB/c小鼠作为动物模型,以尾静脉单次给药后,测定不同时间点的血清药物含量以评价不同多肽缀合物的药代动力学特征。TP5、PEG-TP5和HA-TP5在小鼠体内的药代动力学行为均符合二室模型,根据其血药浓度-时间曲线可知三者体内分布半衰期t1/2q分别为0.5032 min、4.257min和4.01 1min;消除半衰期t1/2β分别为29.45 min、173.9 min和224.5 min,因此TP5经PEG或HA修饰后,其半衰期均显著延长。TP5、PEG-TP5和HA-TP5在药时曲线下面积AU Co-z分别为 193.5μg·mL-1·min、924.2 μg·mL-1·min和2382 μg·mL-1·min,显示PEG/HA-TP5的生物利用度较TP5显著提高。与PCK3145相比,HA-PCK3145在小鼠体内的t1/2α从22.37 min延长至57.58 min,t1/2β从219.5 min延长至3032 min,表明HA修饰的PCK3145半衰期显著延长;与未修饰的PCK3145相比,HA-PCK3145 的AUC0-z从1888μg·mL-1·min延长到6717 μg·mL-1·min,表明修饰后的缀合物具有更高的生物利用度。与ES2-TH相比,HA-ES2-TH在小鼠体内的t1/2α从17.46 min延长至34.99 min,t1/2β从243.3 min延长至1703 min,表明HA修饰的ES2-TH半衰期显著延长;与未修饰的ES2-TH相比,HA-ES2-TH的AUC0-z从510.5μg·mL-·min延长到2958 μg·mL-1·min,表明修饰后的缀合物具有更高的生物利用度。4.多肽缀合物体外活性的表征(1)PEG-TP5和HA-TP5的体外促淋巴细胞增殖活性采用MTT法测定TP5及PEG/HA-TP5体外对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果表明,浓度分别为18.4μmol·L-1、36.8μmol·L-1、73.5μmol·L-1和147.1μmol·lL-1的TP5、PEG-TP5和HA-TP5在体外均具有显著的刺激淋巴细胞增殖的活性(P<0.05);PEG-TP5、HA-TP5的促淋巴细胞增殖率与相同浓度的TP5相比无显著差异(P>0.05),因此IP5由mTGase催化进行PEG或HA修饰,对其体外免疫活性影响不大。(2)HA-PCK3145的体外抗肿瘤细胞增殖活性采用MTT法评价HA-PCK3145体外抗人乳腺癌细胞增殖作用。结果表明,浓度分别为14.26 μmol·L-1、28.52μmol·L-1、57.04 μmol· L-1和114.09 μmol ·L-1的PCK3145和HA-PCK3145体外均具有极显著的抗人乳腺癌细胞增殖作用(P<0.01);相同浓度的HA-PCK3145与PCK3145的抗肿瘤细胞增殖活性相当(P>0.05),因此PCK3145由mTGase催化进行HA修饰对其体外抗肿瘤活性影响不大。(3)HA-ES2-TH的体外抗血管内皮细胞增殖活性采用MTT法评价HA-ES2-TH体外抗血管内皮细胞增殖作用。结果表明,浓度分别为26.18 μmol·L-1、52.36μmol·L-1和104.71 μmol·L-1时,ES2、ES2-TH和HA-ES2-TH在体外均具有极显著的抗血管内皮细胞增殖作用(P<0.01)。相同浓度的HA-ES2-TH与ES2-TH、ES2的抗肿瘤细胞增殖活性相当(P>0.05),因此ES2与归巢肽串联以及由mTGase催化进行HA修饰对其体外抗血管生成活性影响不大。总之,利用mTGase酶催化对TP5、PCK3145及ES2-TH进行PEG/HA定点修饰能够得到一系列纯度高的多肽缀合物;与未修饰的多肽相比,各多肽缀合物的体内半衰期显著延长、生物利用度显著提高,且体外生物活性变化不大。因此酶法PEG/HA定点修饰是一种有发展前途的多肽药物修饰的新策略。