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牦牛是青藏高原及其毗邻地区不可或缺的全能家畜，对高寒气候等恶劣环境有极强的适应性，但其生产性能较低。为了提高牦牛的生产性能，我国从上世纪50年代开始采用良种黄牛与牦牛进行杂交，杂种一代犏牛表现出很强的杂种优势，但其雄性不育使得杂种优势的利用受到了极大的限制，成为牦牛杂交改良的“拦路虎”.为了探讨犏牛雄性不育问题，本研究以成年健康雄性犏牛、黄牛和牦牛为研究对象，运用同源扩增、PCR克隆测序方法获得牦牛印记基因或精子发生相关基因差异甲基化区(DMR)序列，利用Real-time PCR技术检测了这些基因在犏牛及其亲本睾丸组织中的表达差异，运用亚硫酸氢钠测序法检测了相关基因DMR甲基化状态，为研究犏牛雄性不育与DNA甲基化的关系提供理论基础.
1.牦牛H19/IGF2印记控制区(ICR)的分子克隆及序列分析
本实验根据黄牛H19基因DNA序列NW_001494548设计引物扩增出牦牛H19基因长约6.5 kb的序列(GenBank登录号：EU502716)，该序列包含完整的印记控制区(ICR)、启动子和部分第一外显子，用生物信息学方法，将该序列与黄牛、绵羊、猪、人类和小鼠的相应序列比对分析，发现牦牛与他们的相似度分别为97％、83.13％、48％、47％，42％；该扩增序列中共有6个CpG岛，长度分别为1182、1186、707、277、281和1311 bp；有6个锌指蛋白CTCF结合位点，均位于CpG岛内，分别定位于转录起始部位上游5.5 kb、5.1 kb、4.1 kb、3.7 kb、2.7 kb和1.3 kb；H19基因5端存在核心启动子区，TATA box、GC box及Sp1、Sp2、AP2、NF-кB、STAT5、P53、WT1. GFI1、MTBP、CPBP、ZF9、E2F和Myc-Max等识别位点.
2.犏牛及其亲本睾丸组织中H19基因mRNA表达水平、DNA甲基化状态差异分析
本实验运用Real-time PCR技术对犏牛及其亲本睾丸组织中H19基因表达水平进行了分析，结果发现，犏牛的表达水平极显著高于黄牛和牦牛(P<0.01)，而黄牛和牦牛两者之间表达差异不显著(P>0.05).
采用亚硫酸氢钠测序法检测了包含CTCF结合位点3(CTCF-binding siteⅢ)的H19 ICR的甲基化状态，结果发现，犏牛H19 ICR的甲基化水平(48.82％)极显著低于黄牛(70％)(P<0.01)，显著低于牦牛(59.10％)(P<0.05)，但黄牛的甲基化水平显著高于牦牛(P<0.05)；犏牛CTCF结合位点3的甲基化水平(48.33％)极显著低于黄牛(75％)和牦牛(68％)(P<0.01).说明H19 ICR及ICR中的CTCF结合位点对H19基因表达调节具有重要作用.
3.犏牛及其亲本睾丸组织中IGF2基因mRNA表达水平、DNA甲基化状态差异分析
本实验根据黄牛IGF2基因组序列DQ298740设计引物扩增出了牦牛IGF2基因第十外显子部分序列，GenBank登陆号为FJ152104；通过Real-time PCR检测了犏牛及其亲本睾丸组织中IGF2基因的表达水平，运用亚硫酸氢钠测序法检测了睾丸组织中IGF2基因第十外显子DMR的甲基化状态.结果发现，犏牛睾丸组织中IGF2基因mRNA表达水平最低，与亲本的表达水平差异极显著(P<0.01)；黄牛、牦牛和犏牛睾丸中IGF2 DMR的甲基化水平分别为90％、90.7％和92.0％，三组之间均未见显著差异(P>0.05).实验结果说明IGF2基因mRNA表达水平与牛精子发生有关，可能在牛的精子发生过程中发挥重要作用，并可能与犏牛雄性不育有关；IGF2基因第十外显子DMR区的甲基化与IGF2基因在犏牛及其双亲睾丸中的表达差异无关，可能是其他的机制参与调节IGF2基因的表达.
4.犏牛及其亲本睾丸组织中印记基因SNRPN的表达及DMR甲基化分析
本实验根据黄牛SNRPN基因序列NW935049设计引物扩增出了牦牛SNRPN基因5’端序列，长为1137 bp，与黄牛参照序列相似度达98.2％；经生物信息学分析，发现含有YY1和SP1等甲基化敏感位点.通过Real-time PCR检测了犏牛及其亲本睾丸组织中SNRPN基因的表达水平，运用亚硫酸氢钠测序法检测了睾丸组织中SNRPN基因5’端DMR的甲基化状态.结果发现，黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中SNRPN基因mRNA表达差异不显著(P>0.05)，但黄牛和牦牛SNRPN基因的表达高于犏牛；犏牛SNRPN DMR的甲基化水平(38.53％)极显著高于黄牛(21.08％)和牦牛(20.81％)的(P<0.01).说明犏牛SNRPN DMR区的高甲基化本身还不足以引起SNRPN基因表达水平的显著变化，还有其它机制参与SNRPN基因的表达调节.
5.DAZL基因5’端CpG岛DNA甲基化水平及其与犏牛雄性不育的关系研
前期研究发现DAZL基因与犏牛雄性不育相关，是犏牛雄性不育的候选基因.为了进一步研究调控DAZL基因表达的机制，本实验根据黄牛DAZL基因序列(NC_007299，complement:141791034..141818671)设计引物扩增了牦牛DAZL基因的5’端序列，并对牦牛，黄牛和犏牛DAZL基因的甲基化水平进行了分析，结果发现：牦牛DAZL基因的5’端存在CpG岛，CpG岛长1744bp(EU686694:650～2393)，包含启动子区、第一外显子和第一内含子；犏牛DAZL5’端DNA甲基化水平(85.6％)极显著高于黄牛(71.4％)和牦牛(69.8％)(P<0.01).可见犏牛DAZL基因的高甲基化与其mRNA表达缺乏、雄性不育的表型是一致的，说明DAZL基因的甲基化对DAZL基因mRNA的表达调控起重要作用，可能对犏牛生精细胞减数分裂、雄性不育有重要影响.