论文部分内容阅读
目的:通过临床研究观察补阳还五汤治疗慢阻肺合并肺动脉高压的有效性及安全性,利用网络药理学探索其治疗机制及主要通路,通过动物实验予以验证。材料与方法:1.补阳还五汤治疗慢阻肺合并肺动脉高压的临床研究本研究采用前瞻性、随机、双盲、对照的研究方法,观察2019年6月—2020年08月就诊于辽宁中医药大学附属医院门诊及住院部的慢阻肺合并肺动脉高压（气虚血瘀证）的患者。纳入病例67人,随机分为治疗组和对照组,治疗组予补阳还五汤颗粒剂,对照组予形状、气味、外观与治疗组颗粒剂相同的补阳还五汤模拟颗粒剂,两组均根据患者实际病情联合氧疗、抗感染治疗、利尿剂、抗凝等治疗,疗程4周,第12周随访。设置肺功能和超声心动图作为筛选指标,肺功能、超声心动图、中医证候总积分、单项症状评分、慢阻肺CAT评分、6分钟步行试验、Borg量表、BODE指数评分、血气分析、NT-pro BNP、D-二聚体、纤维蛋白原为有效性观测指标,对补阳还五汤治疗慢阻肺合并肺动脉高压的有效性进行评价,记录整个研究过程中出现的不良事件观察药物的安全性,对本研究患者的依从性和安全性进行评价。2.基于网络药理学探讨补阳还五汤治疗慢阻肺合并肺动脉高压的机制通过TCMSP或BATMAN-TCM数据库获得补阳还五汤的活性成分及靶点,Gene Cards数据库获取慢阻肺和肺动脉高压的疾病靶点,提取交叉靶点作为慢阻肺合并肺动脉高压的疾病靶点,将药物靶点与疾病靶点进行映射,构建蛋白相互作用PPI网络,进行基因GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,筛选主要的通路。3.基于PI3K/Akt信号通路探讨补阳还五汤对慢阻肺合并肺动脉高压大鼠血管重构的影响3.1实验一补阳还五汤对慢阻肺合并肺动脉高压大鼠血管重构干预作用的研究将大鼠随机分为空白组、模型组、中药组、西药组和中西医结合组,适应性喂养一周后将除空白组外的其余四组采用脂多糖、烟熏及低氧的方式造慢阻肺合并肺动脉高压大鼠模型,采用边造模边给药的方式进行实验。中药组予13.02g/（kg·d）补阳还五汤灌胃;西药组予12.6ug/（kg·d）贝前列素钠片灌胃;中西医结合组予13.02g/（kg·d）补阳还五汤+12.6ug/（kg·d）贝前列素钠片灌胃;三组均配置成2ml的药物溶液;正常组和模型组予等体积的生理盐水进行灌胃。造模、灌胃4w后,检测大鼠平均肺动脉压力（m PAP）、右心肥厚指数（RV/LV+S）、HE染色并观察肺血管管壁厚度/血管直径百分比（WT%）和血管壁面积/总血管面积百分比（WA%）,判断造模是否成功。制备组织标本后通过TUNEL法检测观察细胞凋亡情况,免疫组化法观察肺小动脉PI3K/Akt通路关键靶点的磷酸化表达。3.2实验二基于PI3K/Akt信号通路探讨补阳还五汤对PASMCs细胞增殖及凋亡的调控机制取出大鼠肺动脉,进行PASMCs的分离及培养,α-SMA抗体免疫荧光法对PASMCs进行鉴定,CCK-8法检测细胞的增殖活性,流式细胞技术检测细胞的凋亡率,western-blot法检测PI3K/Akt通路关键靶点的磷酸化表达及影响细胞增殖的m TOR、p27kip1和PCNA以及影响细胞凋亡相关的Bcl-2、Bax、Cyt c、Caspase-3、caspase-9。结果:1.补阳还五汤治疗慢阻肺合并肺动脉高压的临床研究1.1两组患者治疗前后肺功能结果比较两组患者治疗前肺功能（FEV1占预计值%、FEV1/FVC）差异无统计学意义（P>0.05）,具有可比性;治疗后均较治疗前有所改善,差异有统计学意义（P<0.05）;治疗组与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。1.2两组患者治疗前后超声心动图结果比较两组患者治疗前超声心动图各项结果无明显差异（P>0.05）,具有可比性;治疗后治疗组各项指标明显优于治疗前,且优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;对照组S、RVFAC与治疗前比较未见明显差异（P>0.05）,余各项指标明显优于治疗前,差异有统计学意义（P<0.05）。1.3两组患者治疗后中医证候疗效比较治疗后治疗组临床控制6例（20%）,显效12例（40%）,有效10例（33.33%）,无效2例（6.67%）;对照组临床控制2例（6.67%）,显效10例（33.33%）,有效12例（40%）,无效6例（20%）,治疗组治疗后中医证候疗效优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。1.4两组患者治疗前后中医证候总积分比较治疗前两组患者中医证候积分比较差异无统计学意义（P>0.05）,具有可比性;治疗后两组均较治疗前有所改善,且同一时期治疗组优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;治疗组第12周时与第4周比较差异无统计学意义（P>0.05）。1.5两组患者治疗前后单项症状积分比较治疗前两组患者在喘息、气短、咯痰、疲乏无力、胸闷或痛,痛有定处及面色暗淡等症状评分差异无统计学意义（P>0.05）,具有可比性;治疗后两组患者各项评分均较治疗前明显改善,且同一时期治疗组各项评分优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;第12周时两组各症状评分与第4周比较差异无统计学意义（P>0.05）。1.6两组患者治疗前后CAT评估量表比较两组患者治疗前CAT评分差异无统计学意义（P>0.05）,具有可比性;治疗后两组患者各项评分均较治疗前明显改善,且同一时期治疗组各项评分优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;第12周时两组各症状评分与第4周比较差异无统计学意义（P>0.05）。1.7两组患者治疗前后6分钟步行距离比较两组患者治疗前6分钟步行距离差异无统计学意义（P>0.05）,具有可比性;治疗后两组均较治疗前有所改善,且同一时期治疗组明显优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;治疗组第12周与第4周比较差异无统计学意义（P>0.05）。1.8两组患者治疗前后Borg量表比较两组患者治疗前Borg量表比较差异无统计学意义（P>0.05）,具有可比性;治疗后均较治疗前有所改善,且同一时期治疗组明显优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;治疗组第12周与第4周比较差异无统计学意义（P>0.05）。1.9两组患者治疗前后BODE指数比较两组患者治疗前BODE指数差异无统计学意义（P>0.05）,具有可比性;治疗后均较治疗前有所改善,且治疗组明显优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。1.10两组患者治疗前后血气分析比较两组患者治疗前血气分析（Pa O2、Pa CO2）差异无统计学意义（P>0.05）,具有可比性;治疗后均较治疗前有所改善,且治疗组明显优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。1.11两组患者治疗前后NT-pro BNP比较两组患者治疗前NT-pro BNP差异无统计学意义（P>0.05）,具有可比性;治疗后均较治疗前有所改善,且治疗组明显优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。1.12两组患者治疗前后D-二聚体比较两组患者治疗前D-二聚体差异无统计学意义（P>0.05）,具有可比性;治疗后均较治疗前有所改善,且治疗组明显优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。1.13两组患者治疗前后FIB比较两组患者治疗前FIB差异无统计学意义（P>0.05）,具有可比性;治疗后均较治疗前有所改善,且治疗组明显优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。1.14安全性指标对两组患者治疗前后血尿常规、肝肾功能以及心电图等进行监测,部分患者心电图出现右室大表现,个别指标呈现异常而无临床意义,未见明显异常。2.基于网络药理学探讨补阳还五汤治疗慢阻肺合并肺动脉高压的机制研究应用网络药理学技术共获得96个有效化合物,对应的作用靶点共1140个,根据预设条件获得203个疾病靶点。GO富集分析得到具有显著意义的BP1416个、CC26个和MF68个。KEGG通路分析得到104个具有显著意义的通路。quercetin槲皮素、luteolin木犀草素、beta-caroteneβ胡萝卜素、kaempferol山奈酚和baicalein黄芩素等为主要成分,ALB、IL6、VEGFA、Akt1、IL1B等为主要靶点,AGE-RAGE、Relaxin、PI3K-Akt等为主要通路,分析后得出PI3K-Akt通路在本病中发挥着重要的作用。3.基于PI3K/Akt信号通路探讨补阳还五汤对慢阻肺合并肺动脉高压大鼠血管重构的影响3.1实验一补阳还五汤对慢阻肺合并肺动脉高压大鼠血管重构干预作用的研究3.1.1气管注射LPS、烟熏联合低氧持续4w后模型组大鼠m PAP、右心肥厚指数、HE染色及肺小动脉血管重建指标WT%和WA%与正常组对比明显异常,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）,成功造出COPD-PH的动物模型。3.1.2中药组、西药组和中西医结合组COPD-PH大鼠的一般生活状态明显优于对照组,m PAP、右心肥厚指数、HE染色及肺小动脉血管重建指标WT%和WA%水平较模型组明显改善,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）,中药组与西药组无明显差异（P>0.05）,中西医结合组优于中药组与西药组,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。3.1.3肺小动脉TUNEL结果与空白对照组比较,模型组细胞凋亡数量显著减少,中药组、西药组及中西医结合组细胞凋亡数量明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,中药组、西药组及中西医结合组细胞凋亡数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）;与中药组比较,西药组细胞凋亡数无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）,中西医结合组细胞凋亡数增多,差异有统计学意义（P<0.01）;与西药组比较,中西医结合组细胞凋亡数显著增多,差异有统计学意义（P<0.01）。3.1.4免疫组化法检测肺小动脉PI3K/Akt通路相关指标与空白对照组比较,模型组、中药组、西药组及中西医结合组p-PI3K、p-Akt表达结果上调,差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,中药组、西药组及中西医结合组p-PI3K、p-Akt表达结果下调,差异有统计学意义（P<0.01）;与中药组比较,西药组p-PI3K和p-Akt表达无明显差异（P>0.05）,中西医结合组p-PI3K、p-Akt表达结果下调,差异有统计学意义（P<0.01）;与西药组比较,中西医结合组p-PI3K、p-Akt表达结果下调,差异有统计学意义（P<0.01）。3.2实验二基于PI3K/Akt信号通路探讨补阳还五汤化裁方对PASMCs细胞增殖及凋亡的调控机制3.2.1免疫荧光法鉴定PASMCs结果细胞均呈α-SMA阳性绿色荧光,可见明显肌丝,呈与细胞平行的丝状梭形排列,大鼠肺动脉成功提取出PASMCs。3.2.2western-blot法检测各组PASMCs的p-PI3K、p-Akt的蛋白表达结果与空白对照组比较,模型组、中药组、西药组及中西医结合组p-PI3K、p-Akt表达结果上调,差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,中药组、西药组及中西医结合组p-PI3K、p-Akt表达结果下调,差异有统计学意义（P<0.01）;与中药组比较,西药组p-PI3K和p-Akt表达无明显差异（P>0.05）,中西医结合组p-PI3K、p-Akt表达结果下调,差异有统计学意义（P<0.01）;与西药组比较,中西医结合组p-PI3K、p-Akt表达结果下调,差异有统计学意义（P<0.01）。3.2.3CCK-8细胞增殖检测结果与空白对照组比较,模型组、中药组、西药组及中西医结合组细胞增殖活性明显增强,差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,中药组、西药组及中西医结合组细胞增殖活性显著降低,差异有统计学意义（P<0.01）;与中药组比较,西药组细胞增殖活性无明显差异,中西医结合组细胞增殖活性显著降低,差异有统计学意义（P<0.01）;与西药组比较,中西医结合组细胞增殖活性显著降低,差异有统计学意义（P<0.01）。3.2.4western-blot法检测各组PASMCs的p-m TOR、PCNA、p27kip1蛋白表达结果与空白对照组比较,模型组、中药组、西药组及中西医结合组p-m TOR、PCNA的表达显著上调,p27kip1的表达显著下调,差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,中药组、西药组及中西医结合组p-m TOR、PCNA的表达显著下调,p27kip1的表达显著上调,差异有统计学意义（P<0.01）;与中药组比较,中西医结合组p-m TOR、PCNA的表达显著下调,p27kip1的表达显著上调,差异有统计学意义（P<0.01）,西药组p-m TOR、PCNA、p27kip1的表达与中药组无显著差异（P>0.05）;与西药组比较,中西医结合组p-m TOR、PCNA的表达显著下调,p27kip1的表达显著上调,差异有统计学意义（P<0.01）。3.2.5流式细胞术检测细胞凋亡率结果与空白对照组比较,模型组细胞凋亡率降低,差异有差异有统计学意义（P<0.05）;中药组、西药组及中西医结合组细胞凋亡率增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,中药组、西药组及中西医结合组细胞凋亡率增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与中药组比较,西药组细胞凋亡率无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）,中西医结合组细胞凋亡率增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与西药组比较,中西医结合组细胞凋亡率增加,差异有统计学意义（P<0.01）。3.2.6western-blot法检测各组PASMCs的Bcl-2、Bax、Cyt C、caspase-9及caspase-3蛋白表达结果与空白对照组比较,模型组Bcl-2表达显著上调,中药组、西药组及中西医结合组Bcl-2表达显著下调,模型组Bax、Cyt C、caspase-9及caspase-3表达显著下调,中药组、西药组及中西医结合组Bax、Cyt C、caspase-9及caspase-3表达显著上调,差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,中药组、西药组及中西医结合组Bcl-2表达显著下调;Bax、Cyt C、caspase-9及caspase-3表达显著上调,差异有统计学意义（P<0.01）。与中药组比较,西药组Bcl-2、Bax、Cyt C、caspase-9及caspase-3表达与中药组无明显差异（P>0.05）,中西医结合组Bcl-2显著下调,Bax、Cyt C、caspase-9及caspase-3显著上调,差异有统计学意义（P<0.01）。与西药组比较,中西医结合组Bcl-2显著下调,Bax、Cyt C、caspase-9及caspase-3显著上调,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:1.补阳还五汤能够改善气虚血瘀型COPD-PH患者喘促、气短等临床症状,改善低氧状态,改善心肺功能,增加运动耐力,同时改善生活质量,其机制可能与缓解缺氧、高碳酸血症和呼吸性酸中毒等导致的肺血管收缩痉挛,降低血液粘稠度、预防原位血栓形成等密切相关,临床安全性高。2.补阳还五汤中的槲皮素、木犀草素、山奈酚等有效成分,可以作用于ALB、IL6、VEGFA等靶点,通过调控AGE-RAGE、PI3K-Akt、TNF等信号通路,参与细胞凋亡、细胞增殖、炎症反应等多种生物过程达到治疗COPD-PH的作用。3.补阳还五汤能够调控PI3K/Akt信号通路起到抑制PASMCs增殖,促进PASMCs凋亡,抑制血管重构的作用,从而降低COPD-PH肺动脉压力的作用。