【摘 要】
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目的通过超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-HRMS）检测损伤后骨骼肌的代谢轮廓,分析骨骼肌代谢物随损伤时间的变化规律;在此基础上,运用Logistic回归（LR）、支持向量机（SVM）、随机森林（RF）以及多层感知机（MLP）四种机器学习算法建立数学模型用于损伤时间的预测,通过多个数学模型的串联,建立更为精确的骨骼肌损伤时间推断模型。方法实验选取7-8周龄,重约200-250g的雄性SD大鼠
【基金项目】
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国家自然科学基金“国家自然基金青年项目,肌肉代谢特征谱结合人工神经网络技术在损伤时间推断中的应用研究（编号:81901924）”； 山西省应用基础研究项目,液质联用技术用于肌肉损伤时间推断的法医学研究（编号:201801D221264）；
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目的通过超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-HRMS）检测损伤后骨骼肌的代谢轮廓,分析骨骼肌代谢物随损伤时间的变化规律;在此基础上,运用Logistic回归（LR）、支持向量机（SVM）、随机森林（RF）以及多层感知机（MLP）四种机器学习算法建立数学模型用于损伤时间的预测,通过多个数学模型的串联,建立更为精确的骨骼肌损伤时间推断模型。方法实验选取7-8周龄,重约200-250g的雄性SD大鼠共计117只,随机分为对照组、损伤组（损伤时间设定为4～48h,每隔4小时设置一组,共12个损伤时间组）,每组9只大鼠,在预设时间点进行骨骼肌挫伤模型造模。利用UPLC-HRMS分析骨骼肌样品中的代谢谱,以OPLS-DA模型VIP>1以及FDR-adjust P<0.05为依据从代谢谱数据中筛选差异变量,并将各差异变量的精确质量数、二级谱图与mz Cloud数据库中标准谱图对差异变量进行鉴定。将差异代谢物信息导入到Metaboanalyst 5.0以及Cytoscape等在线数据库或软件进行代谢通路相关分析。而后经鉴定的差异代谢物数据进行机器学习模型构建。由于本实验采集的损伤时间点较多,用单一的数学模型难以将这些时间点区分开,因此在建模过程中,首先将4-48h之间的12个时间点大致的划分为3个大的时间段（第一层）,再进行二次建模将大的时间段中的各个时间点进行区分（第二层）。最后通过Python软件将两级模型串联,从而实现串联机器学习模型的构建。先用OPLS-DA模型确定第一层时间段标签,而后运用4种机器学习模型通过交叉验证分别建立损伤时间推断模型,选取准确率最高的模型作为最终的第一层损伤时间推断模型;而后再次运用OPLS-DA模型在第一层时间段标签的基础上确定构建第二层时间段标签,经过交叉验证,同样选取准确率最高的模型作为最终的第二层损伤时间段推断模型。而后将上述搭建的两层模型串联,第一层模型可以输出样本的第一层时间段标签,而第二层模型可以输出样本的第二层时间段标签。最后再另选取13只大鼠挫伤骨骼肌代谢数据作为外部验证数据集以评估最终串联模型用于损伤时间推断的性能。结果通过代谢组学分析,从挫伤骨骼肌中共鉴定出随损伤时间变化的43种差异代谢物,代谢物功能主要集中在初级胆汁酸合成、氨基酰-t RNA合成、苯丙氨酸,酪氨酸生物合成、不饱和脂肪酸生物合成、花生四烯酸代谢等方面。运用OPLS-DA模型,初步将第一层时间段确定为4-12h（groupⅠ）,16-32h（groupⅡ）,以及36-48h（groupⅢ）,第二层时间段为4h、8h、12h、16-20h、24-32h、36-40h以及44-48h。通过四种机器算法对上述时间段进行交叉验证评估,在第一层时间段MLP模型验证准确率为93.9%,LR、SVM、RF的验证准确率分别为87.8%、81.8%及84.8%。在第二层时间段中,MLP模型验证结果均优于LR、SVM和RF模型,在MLP模型中可将groupⅠ分为4h、8h及12h,将groupⅡ分为16-20h及24-32h,将groupⅢ分为36-40h及44-48h,验证准确率分别达到了100%,92.8%,及90.9%。通过python语言编写串联模型代码实现第一层MLP与第二层MLP串联,用13个外部验证数据进行验证,得到串联模型的最终准确率为61.5%。结论在本研究中,共发现43种可用于骨骼肌损伤时间推断的小分子代谢物,以此为基础建立了用于损伤时间推断的MLP-MLP串联机器学习数学预测模型,模型外部验证准确率达61.5%。本研究通过python软件自编代码将两层机器学习模型串联,将损伤时间推断的时间窗缩短至4小时,为动物数据应用于法医实践工作提供了一个有效的解决途径。
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