目的分析重型再生障碍性贫血(Severe aplastic anemia,SAA)患者调节性自然杀伤细胞(CD56bright Natural Killer cells,CD56bright NK cells)数量、表面受体及产生细胞因子的水平;体外分离NK细胞,验证SAA患者NK细胞产生特定细胞因子的信号通路激活状态;探索SAA患者NK细胞对其他免疫细胞分化、增殖与功能的影响,揭示调节性NK细胞在SAA免疫发病机制中的作用,为细胞免疫治疗提供理论依据。方法连续收集自2015年1月至2016年12月在天津医科大学总医院血液内科住院治疗的SAA初治患者21例、治疗后缓解患者21例为实验组实验对象,健康志愿者22例为正常对照。第一部分采用流式细胞术检测SAA初治患者、SAA恢复期患者(SAA response to immunosuppressive therapy,SAA-CR+PR)和正常对照者(Healthy Controls,HC)外周血NK细胞亚群(CD56bright NK细胞和CD56d im NK细胞)数量并与患者临床指标做相关性分析。流式细胞术检测NK细胞亚群表面激活性受体NKp46、NKp44、NKG2D,抑制性受体NKG2A、CD158a、CD158b,胞内蛋白穿孔素、颗粒酶B,粘附分子DNAM-1,胞内产生细胞因子IFN-γ、IL-17a、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β的表达情况。检测SAA患者外周血血浆IL-2和IL-12水平,分选正常对照者CD56bright NK细胞,以rh IL-2和rh IL-12体外刺激培养,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测不同时间段IFN-γ和IL-10 m RNA表达。第二部分免疫磁珠分选初治SAA、缓解期SAA和正常对照者NK细胞,应用rh IL-2和rh IL-12体外刺激培养,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测NK细胞上清IFN-γ、IL-10和TGF-β水平,q RT-PCR检测IFN-γ、IL-10、TGF-β、STAT4、p38、STAT6 m RNA的表达,蛋白质印迹法(Western Blot)检测NK细胞STAT4、p-STAT4、p38、p-p38的表达。第三部分免疫磁珠分选SAA和正常对照者NK细胞,分别与SAA患者免疫磁珠分选且体外激活的CD4+T细胞、CD8+T细胞和诱导分选的髓样树突状细胞(myeloid Dendritic Cells,m DC)共培养,流式细胞术检测NK细胞经自体CD4+T细胞刺激前后脱颗粒水平、CD4+T细胞共培养前后Th1、Th2、Th17、调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)数量、CD8+T细胞胞内细胞毒性颗粒(穿孔素和颗粒酶B)的表达、m DC表面共刺激分子CD86、CD80表达,CCK-8检测CD8+T细胞和m DC增殖活性,q RT-PCR检测CD4+T细胞转录因子T-bet、GATA3、RORγt和FOXP3 m RNA的表达。结果第一部分初治SAA患者CD56bright NK/NK百分比为(4.33±2.53)%,较HC组(7.46±2.53)%显著降低(p=0.001),而初治SAA患者CD56dim NK/NK百分比(95.67±2.54)%与正常对照者未见明显差异;初治SAA患者CD56brightNK绝对值为(3.26±2.85)×106/L,较HC组(10.94±5.34)×106/L明显降低(p<0.01),CD56brightNK绝对值随SAA病情缓解而上升为(10.13±6.81)×106/L(p<0.01)。初治SAA患者CD56bright NK细胞绝对值与血小板(PLT)绝对值(R=0.735,p<0.01)、网织红细胞(Ret)绝对值(R=0.755,p<0.01)、Ret百分比(R=0.670,p<0.01)呈正相关。初治SAA患者CD56brightNK细胞NKp46阳性率(99.61±0.61)%及平均荧光强度(MFI)(361.56±70.71)均高于HC阳性率(81.27±7.09)%及MFI(118.58±48.76)(p<0.01)。初治SAA患者CD56brightNK细胞NKp44阳性率(13.37±6.65)%及MFI(14.17±4.43)明显高于正常对照者阳性率(3.55±3.32)%及MFI(5.91±2.12)(p<0.01)。SAA初治患者CD56bright NK细胞NKG2D之MFI(216.82±50.07)明显高于HC(126.42±37.84)(p<0.01)。初治SAA患者CD56brightNK细胞NKG2A阳性率(63.49±23.66)%较HC(83.09±14.83)%明显降低(p=0.006)。初治SAA患者CD56brightNK细胞表达极低的CD158a和CD158b,与HC比较没有统计学差异。初治SAA患者产生穿孔素、颗粒酶B的CD56brightNK细胞百分比与缓解期SAA、正常对照者无明显差异。初治SAA患者(96.68±1.73)%的CD56bright NK细胞呈现DNAM-1+,高于HC(94.49±2.15)%(p=0.020)。PMA刺激后,初治SAA患者产生IFN-γ的CD56bright NK细胞为(17.0±4.1)%,较正常对照者(23.2±6.4)%明显减低(p=0.010)。初治SAA患者产生IL-10的CD56brightNK细胞百分比为(5.19±2.60)%高于缓解期SAA(3.42±1.14)%(p=0.031)及对照(2.36±0.58)%(p<0.01)。初治SAA患者产生IL-4的CD56brightNK细胞占(0.95±0.42)%,高于缓解期SAA(0.56±0.25)%(p=0.002)及对照(0.34±0.22)%(p<0.01)。初治SAA患者的CD56brightNK细胞产生TGF-β的百分比为(5.57±2.43)%,高于缓解期SAA(3.94±0.81)%(p=0.040)及对照(3.19±0.48)%(p=0.002)。SAA患者CD56b rightNK产生IL-17a、TNF-α、IL-13的水平与对照无差异。初治SAA患者血浆IL-2、IL-12浓度分别为(156.3±23.5)和(28.9±6.1)pg/m L,明显高于缓解期SAA(IL-2:(112.6±27.3)pg/m L、IL-12:(22.4±7.9)pg/m L)(p<0.01),及对照(IL-2:(30.0±8.6)pg/m L、IL-12:(20.4±5.1)pg/m L)(p<0.01)。免疫磁珠分选的健康对照者的CD56bright NK细胞纯度大于70%。对照者的CD56bright NK细胞IFN-γm RNA相对表达量在rh IL-2和rh IL-12刺激3天时明显升高(1.44±0.13)(p=0.009),刺激7天时明显下降(0.79±0.12)(p=0.002)。对照者的CD56bright NK细胞IL-10 m RNA相对表达量在rh IL-2和rh IL-12刺激3天时未见明显变化(1.24±0.54),刺激7天时出现升高(2.67±1.29)(p=0.026)。第二部分分选NK细胞纯度大于95%。初治SAA患者NK细胞分泌IFN-γ为(95.6±36.1)pg/m L,较缓解期SAA(100.4±38.5)pg/m L及对照(105.3±54.4)pg/m L有下降趋势,但无统计学差异。初治SAA患者NK细胞IFN-γm RNA相对表达量为(0.09±0.05)明显低于缓解期SAA(0.67±0.32)(p<0.01)及对照(1.04±0.32)(p<0.01)。初治SAA患者NK细胞STAT4 m RNA相对表达量(中位数为0.25(0.01,1.53))明显低于正常对照者(中位数0.93(0.18,4.92))(p=0.001)。Western Blot检测初治SAA患者NK细胞STAT4激活率(p-STAT4/STAT4)为(0.76±0.09),低于缓解期SAA患者(0.87±0.09)(p=0.020)和正常对照者(0.95±0.10)(p<0.01)。初治SAA患者NK细胞分泌IL-10水平(16.5±6.9)高于缓解期SAA(11.0±7.5)(p=0.012)及正常对照者(9.3±6.6)(p=0.005)。初治SAA患者NK细胞IL-10 m RNA相对表达量为(4.01±2.37)高于缓解期SAA(2.84±2.95)(p=0.030)及正常对照者(1.75±1.79)(p<0.01)。初治SAA患者NK细胞p38 m RNA相对表达量(2.25±1.26)高于正常对照者(1.51±1.32)(p=0.038)。初治SAA患者NK细胞p38激活率(p-p38/p38)为(1.08±0.22),高于缓解期SAA患者(0.83±0.16)(p=0.003)和正常对照者(0.64±0.13)(p<0.01)。初治SAA患者NK细胞STAT6 m RNA相对表达量(中位数3.41(0.33,10.41))高于对照者(中位数1.36(0.27,4.08))(p=0.001)。初治SAA患者NK细胞分泌TGF-β水平(93.2±39.0)高于对照者(61.4±17.5)(p=0.009)。初治SAA患者NK细胞TGF-βm RNA相对表达量为(3.45±2.37)高于对照者(1.60±1.48)(p=0.007)。第三部分分选NK、CD4+T、CD8+T细胞纯度均大于95%。诱导分选m DC细胞纯度大于70%。当经rh IL-2培养刺激的NK细胞与自体激活的CD4+T细胞共培养后,初治SAA患者CD107a+NK细胞百分比(28.68±12.44)%明显较对照者升高(17.05±9.04)%(p=0.017)。初治SAA患者Th1细胞数量及Th1/Th2比例较对照者明显升高。与初治SAA患者NK细胞共培养后,CD4+T细胞中Th1细胞数量减少、T-bet m RNA相对表达量(0.99±0.54)降低,Th2细胞数量增多、GATA3 m RNA相对表达量(1.94±0.96)增多,Th1/Th2比例下降。初治SAA患者Th17细胞数量升高、Treg数量下降、Th17/Treg比例升高。初治SAA患者CD4+T细胞与SAA来源的NK细胞共培养后,Th17细胞数量减少、RORγt m RNA相对表达量(0.55±0.40)降低,Treg细胞数量升高、FOXP3 m RNA相对表达量(2.00±0.91)升高,Th17/Treg比例下降。与初治SAA患者NK细胞共培养(+SAA NK)的CD8+T细胞增殖抑制率(4.50±1.79)%与HC的NK细胞共培养(+HC NK)抑制率(3.44±1.31)%无明显差异。但+HC NK组CD8+T细胞穿孔素和颗粒酶B表达率(分别为(29.70±6.18)%和(45.26±9.01)%)较无NK共培养组(Ctrl)(分别为(24.75±5.50)%和(35.29±7.41)%)升高(p<0.05),而+SAA NK组未使CD8+T细胞胞内穿孔素和颗粒酶B表达升高。+SAA NK组m DC细胞增殖抑制率(5.55±1.65)%高于+HC NK组抑制率(4.31±1.60)%(p=0.047)。+HC NK组m DC细胞CD80表达率(89.16±6.77)%较+SAA NK组(83.75±6.59)升高(p=0.037),各组间CD86表达没有差异。结论1、SAA患者CD56bright NK细胞数量显著减少,且与患者多项外周血细胞数指标呈正相关,即CD56bright NK细胞数量越少,病情越重,经强化免疫抑制治疗(IST)后CD56bright NK细胞数量有所改善。2、SAA患者CD56bright NK细胞激活性受体升高,抑制性受体降低,细胞处于激活状态;粘附分子表达DNAM-1增强,可能具有更强的迁移能力,穿孔素和颗粒酶B产生较少,细胞毒性作用不明显,产生Ⅰ型细胞因子(IFN-γ)减少,Ⅱ型细胞因子(IL-10、TGF-β)增多,可能起到调节SAA疾病状态的作用。3、SAA患者外周血血浆IL-2和IL-12浓度升高。正常对照者CD56bright NK细胞在rh IL-2和rh IL-12刺激下呈现随时间依赖性IFN-γ先升高后降低,IL-10随时间升高,与IL-2的自调节作用可能相关。4、SAA患者NK细胞在rh IL-2和rh IL-12体外刺激下,JAK-STAT4—IFN-γ信号通路下调,而p38 MAPK—IL10、TGF-β信号通路上调,从而产生IFN-γ水平下降,IL10水平升高,IL-10的产生升高可能也与JAK-STAT6上调有关。5、SAA患者Th1/Th2和Th17/Treg升高。SAA患者CD4+T细胞体外在与SAA患者NK细胞共培养后,Th1/Th2和Th17/Treg比例下调,即SAA患者NK细胞可参与调控CD4+T细胞分化以改善疾病情况的失平衡状态。6、SAA患者NK细胞体外对CD8+T细胞增殖抑制没有明显作用,但较HC来源NK细胞可对CD8+T细胞胞内穿孔素和颗粒酶B的产生具有一定下调作用,抑制CD8+T细胞的活化,改善SAA机体T细胞功能亢进状态。7、SAA患者NK细胞体外对m DC细胞增殖具有抑制作用。且对m DC细胞表面共刺激分子CD80表达具有一定下调作用,继而减弱其抗原提呈能力,减弱T细胞激活。