逆境因素包括干旱、高盐和低温等,是全球范围内造成作物产量减少和质量下降的主要原因。为对抗越来越严峻的环境气候条件,植物进化出了非常复杂的分子调控网络来调控形态和生理上的变化,以适应各种不良环境。这些调控通常是通过感受外界刺激,从而激活或者抑制基因的转录而实现的。转录因子在响应环境信号变化,调控基因表达变化中起重要作用。WRKY是一类植物特有的转录因子,虽然大量的研究表明WRKY转录因子广泛参与植物对多种逆境胁迫的调节,但其多数成员在植物对非生物逆境胁迫响应过程中的分子机制还不十分清楚。小麦是人类的主要粮食作物和牲畜饲料,但由于其属于异源六倍体,基因组结构异常复杂,至今小麦中有关WRKY的研究报道很少。考虑到WRKY转录因子在复杂的环境条件下的多重作用,小麦基因组中WRKY基因家族的鉴定、克隆及其成员生物学功能的研究是一项非常有挑战的工作。本研究旨在初步分析小麦基因组中WRKY家族组成的基础上,探索WRKY是否能够赋予植物对非生物逆境胁迫的耐受性,以及小麦WRKY基因赋予植物对非生物胁迫的耐受性的生理和分子机制。我们首先在数据库中搜索WRKY结构域的基础上,成功克隆了其中10个WRKY候选基因。通过分析了小麦模式品种中国春(Triticum aestivum L. cv. Chinese Spring)中WRKY基因家族与非生物胁迫的关系,进一步利用遗传学、生理学及生物化学和分子生物学的方法研究了其中一个成员一—TaWRKY10在非生物胁迫中的功能和作用机制。本研究取得的主要研究结果如下：经过在DFCI数据库和小麦基因组数据库中对WRKY保守序列的搜索,我们从小麦叶片中分克隆到了10个WRKY转录因子基因的全长cDNA序列,分别命名为TaWRKY1-TaWRKY10。这10个WRKY转录因子均含有保守的WRKY结构域和锌指结构。进化分析结果显示,这10个WRKY转录因子分属于3个亚类：TaWRKY4,8和9属于第一亚类,TaWRKY1,2,3,6和10属于第二亚类,TaWRKY5和7属于第三亚类。小麦TaWRKY10转录因子基因cDNA全长为791bp(GenBank编号：HQ700327),包括一个672bp的开放阅读框,编码的Ta WRKY10蛋白含有223个氨基酸,预测的蛋白质相对分子质量为24.5kDa。多重序列比对结果显示,TaWRKY10蛋白包含一个保守的60个氨基酸的DNA结合域(WRKY结构域)和一个锌指结构(C-X4-C-X23-H-X-H)。TaWRKY10与其它已报道的WRKY蛋白,如大麦和玉米中的WRKY蛋白具有较近的亲缘关系。器官差异表达分析表明,TaWRKY10基因在叶中表达量较高,在根中的表达量则较低。TaWRKY10基因的表达能够显著受到渗透、低温和高盐胁迫、和双氧水诱导上调。Southern Blot实验结果显示,TaWRKY10基因在六倍体小麦基因组中是以三个拷贝的形式存在的。TaWRKY10-GFP融合蛋白经基因枪轰击至洋葱表皮细胞,荧光显微镜观察结果显示,绿色荧光和细胞核特异性染料DAPI影像能够完全融合,表明TaWRKY10-GFP定位在细胞核中。酵母转录激活实验结果显示,报告基因His和LacZ可以被TaWRKY10全长和N端区域激活,这表明TaWRKY10是一个有转录激活活性的转录因子,并且其转录激活位点位于其N端。将TaWRKY10基因克隆到pSN1301植物表达载体,利用农杆菌介导的转化方法成功获得了转基因烟草株系。T2代转基因烟草表型分析结果表明,过表达TaWRKY10能够增强转基因烟草对渗透和高盐胁迫的耐受能力。具体表现为：在渗透和高盐胁迫处理条件下,与野生型比较过表达TaWRKY10基因烟草幼苗具有较高的种子萌发率和较长的根长；转基因烟草幼苗在控水处理3周或高盐处理3周后比野生型烟草具有更高的存活率、相对含水量、脯氨酸含量和可溶性糖含量,同时具有更低的黄叶率和丙二醛含量。超氧阴离子和双氧水的组织定位染色结果表明,TaWRKY10基因过表达在干旱和高盐处理下都能够降低烟草植株体内的超氧阴离子和双氧水的积累。渗透胁迫相关基因表达分析表明,在正常生长条件下,NtERD10C、NtSPSA和NtGPX基因的表达量在转TaWRKY10基因烟草植株中显著高于野生型。为了进一步研究TaWRKY10基因在小麦中的功能,我们将TaWRKY10基因克隆到pAHC25植物表达载体,利用基因枪转化方法转化小麦郑麦9023,经过PCR法和Western Blot发鉴定证实,已成功获得了过表达TaWRKY10基因的转基因小麦株系,现在转基因小麦后代繁育工作还在进行中。以上结果表明,TaWRKY10作为一个转录因子通过调控渗透压平衡、清除超氧阴离子和胁迫防御相关基因的表达从而赋予植物对渗透、干旱及氧化胁迫的耐受性。