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第一部分缺氧对人乳腺癌细胞微球体培养的影响目的研究缺氧对人乳腺癌细胞微球体(mammospheres,MSs)培养速率及效率的影响,以探讨优化乳腺癌干细胞富集方法的可能途径。方法分别在缺氧及常氧状态下对经化疗后的人乳腺癌组织细胞进行无血清悬浮培养,并观察记录其成球速率。利用流式细胞检测技术分别检测缺氧组与常氧组MSs及MDA-MB-231细胞中CD44+CD24-/Low表型细胞比例。Western blotting检测三组细胞中乳腺癌干细胞分子标记物CD44、CD24及ALDH1的表达情况。结果缺氧组MSs无论成球速率还是球体直径均优于常氧组MSs,P<0.05。流式细胞检测发现缺氧组MSs中CD44+CD24-/Low表型细胞比例为82.35±6.28%,高于常氧组MSs的1.17±0.05%,P<0.05。Westernblotting检测提示缺氧组MSs中CD44与ALDH1的表达量显著高于常氧组MSs与MDA-MB-231细胞。缺氧组MSs中CD24表达量与常氧组MSs及MDA-MB-231细胞无统计学差异,P>0.05。结论缺氧状态可以提高MSs无血清悬浮培养速率,且增加MSs中表达乳腺癌干细胞特定分子标记物细胞的比例。缺氧与无血清悬浮非粘附培养MSs相结合的方法可用于乳腺癌干细胞的分选。第二部分缺氧对人乳腺癌细胞微球体迁移、侵袭与动物成瘤特性的影响及相关机制初探目的研究缺氧对人乳腺癌细胞微球体(mammospheres,MSs)迁徙、侵袭及动物成瘤能力的影响,并对其发生机制做初步探讨。方法利用细胞划痕、Transwell实验检测缺氧组人乳腺癌细胞微球体细胞(mammospheres-derived cells,MSDCs)与常氧组MSDCs迁徙、侵袭能力之间的差异。通过裸鼠成瘤实验检验缺氧组与常氧组MSDCs在裸鼠体内的成瘤情况,并记录移植瘤成瘤时间与瘤体体积。免疫组织化学检测缺氧组及常氧组移植瘤组织中HIF-2α、ABCG2的表达。Western blotting及RT-PCR定量检测缺氧组MSDCs、常氧组MSDCs与MDA-MB-231细胞中HIF-2α、ABCG2与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标记物E-Cadherin、Twist、Vimentin、N-Cadherin的表达情况。Western blotting及Real time RT-PCR检测缺氧组、常氧组裸鼠移植瘤及瘤旁组织中VEGF与EGF的表达。结果细胞划痕实验48h后缺氧组MSDCs的修复指数92.52±9.36%高于常氧组MSDCs修复指数31.75±6.21%,P<0.05。Transwell实验结果提示缺氧组MSDCs穿膜细胞数达到76.24±10.35,而常氧组MSDCs穿膜细胞为27.38±8.18个,P<0.05。缺氧组MSDCs在裸鼠体内成瘤速度及移植瘤体积均强于常氧组MSDCs,P<0.05。免疫组织化学检测发现缺氧组移植瘤组织中HIF-2α与ABCG2表达强于常氧组移植瘤。Western blotting及Real time RT-PCR检测结果提示:缺氧组MSDCs中HIF-2α、ABCG2、Twist、Vimentin、N-Cadherin表达量高于常氧组MSDCs及MDA-MB-231细胞,P<0.05。缺氧组MSDCs及常氧组MSDCs中E-Cadherin均低表达,且两组间无统计学差异,P>0.05。缺氧组移植瘤中VEGF、EGF表达高于常氧组移植瘤与瘤旁组织,P<0.05。结论缺氧状态提高MSs的迁徙、侵袭及动物成瘤能力,并且推测其可能机制为缺氧促进MSs中HIF-2α活化,然后诱导上皮间质转化并上调VEGF、EGF的表达,从而改变MSs相关生物学特性。第三部分ABCG2慢病毒过表达载体构建及其转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞目的构建ABCG2过表达慢病毒载体,并建立人乳腺癌MDA-MB-231细胞ABCG2过表达模型。方法应用ABCG2过表达慢病毒载体转染MDA-MB-231细胞,计算其转染效率。并通过Western blotting技术检测经慢病毒转染后的MDA-MB-231细胞在经过传代培养后,其中ABCG2蛋白的表达情况。结果成功构建ABCG2过表达慢病毒载体,在MDA-MB-231细胞中其转染效率为95.6±3.5%。传代培养后的慢病毒转染组MDA-MB-231细胞中ABCG2蛋白表达量高于对照组MDA-MB-231细胞,P<0.05。结论ABCG2过表达慢病毒载体能有效转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,并稳定表达。第四部分缺氧对人乳腺癌细胞微球体化疗耐药性的影响及其机制研究目的探讨缺氧对人乳腺癌细胞微球体(MSs)化疗耐药性的影响及其相关机制初步研究,为乳腺癌干细胞化疗耐药性相关研究提供实验基础。方法分别在常氧及缺氧条件下对人乳腺癌MDA-MB-231细胞进行无血清悬浮培养,并观察MSs的生长速率及体积变化。MTT比色法检测缺氧组与常氧组人乳腺癌微球体细胞(mammospheres-derivedcells,MSDCs)及ABCG2过表达慢病毒转染组与对照组MDA-MB-231细胞在不同浓度、不同药物作用下的存活率(survive Rate,SR)变化。免疫荧光化学法检测HIF-2α、ABCG2在各组MSDCs中的表达。Westernblotting检测ABCG2蛋白在缺氧组MSDCs与病毒转染组MDA-MB-231细胞中的表达。Western blotting及Real-time RT-PCR检测HIF-2α、ABCG2、P-gp及MDR1在各组MSDCs中的表达情况。结果缺氧组MSs生长速率及球体体积优于常氧组。缺氧组MSDCs与慢病毒转染组MDA-MB-231细胞在化疗药物作用后的生存率下降趋势相近,在药物浓度较低时无统计学差异,P>0.05。缺氧组MSDCs在化疗药物作用后的生存率下降趋势低于常氧组MSDCs与对照组MDA-MB-231细胞,P<0.05。免疫荧光化学检测发现HIF-2α及ABCG2在缺氧组MSDCs中的表达强于常氧组。缺氧组MSDCs中HIF-2α、ABCG2及P-gP蛋白表达量均高于在常氧组MSDCs及MDA-MB-231细胞中的表达,P<0.05。Western blotting检测发现ABCG2蛋白在缺氧组MSDCs与慢病毒转染组MDA-MB-231细胞组中表达无统计学差异,P>0.05。Real time RT-PCR检测发现缺氧组MSDCs中HIF-2α、ABCG2及MDR1mRNA的表达量均高于常氧组MSDCs及MDA-MB-231细胞,P<0.05。结论以HIF-2α为启动因子,ABCG2、MDR1及P-gp等为效应因子的生物化学信号通路可能是缺氧增强MSs化疗耐药能力的可能机制。