一、研究背景肺癌是目前世界上发病率最高的恶性肿瘤,而且全世界肺癌发病率还在以每年0.5%的速度增长。尽管在诊断和治疗手段上不断有新的进展,其预后仍不佳,五年生存率仅为8-15%。肺癌中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占75-80%,目前最有效的化疗方案对晚期NSCLC的缓解率仅30%左右。寻求新的有效的肺癌治疗药物,进一步提高临床疗效,已成为当前迫切需要研究的课题之一。昆布是中医中药抗癌配方中的常用药物,其应用已有上千年的历史。新近从昆布中提取的类胡萝卜素单体-岩藻黄质,经前期研究发现其对肿瘤细胞有明显的杀伤作用,但是对NSCLC细胞是否存在作用尚不得而知。虽已知岩藻黄质可诱导肿瘤细胞凋亡,阻滞细胞周期,但是其具体机制仍不明确。本研究在体外培养肿瘤细胞模型和人肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型中,应用CCK-8法、流式细胞术、实时定量PCR、免疫印迹、比色法、HE染色法、免疫组化、TUNEL染色法等技术和方法,深入研究岩藻黄质在体内外水平发挥NSCLC生长抑制作用的可能机制。二、方法1.体外培养七种恶性肿瘤细胞(人红白血病细胞株K562、人急性早幼粒白血病细胞株HL-60、人白血病T淋巴细胞株Jurkat、人淋巴瘤巨噬细胞细胞株U937、人乳腺癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株HepG2、人宫颈癌细胞株Hela),并以人正常肝细胞株L-02为对照。台盼兰拒染法检测上述细胞接触不同浓度(0、3.125、6.25、12.5、25、50μM)岩藻黄质24 h后肿瘤细胞的存活率,并检测K562、Jurkat、U937这三种血液系统恶性肿瘤细胞分别接触上述浓度的岩藻黄质24 h、48h及72 h后,肿瘤细胞的存活率。2.流式细胞术检测K562、Jurkat、U937细胞接触不同浓度(0、6.25、12.5、25、50μM)岩藻黄质48 h后,细胞周期分布的变化。3. AnnexinV-FITC法检测K562、Jurkat、U937细胞接触不同浓度(0、12.5、25、50μm)岩藻黄质48 h后,对细胞凋亡率的影响。4.培养四种人非小细胞肺癌细胞(人大细胞肺癌细胞株NCI-H460,人肺腺癌细胞株NCI-A549、SPC-A-1、NCI-H199),采用CCK-8法检测不同浓度(0、12.5、25、50、75、100μm)岩藻黄质作用24 h、48 h和72 h后肿瘤细胞的存活率。5.流式细胞术检测A549和H1299细胞这两种p53基因表型不同的NSCLC细胞接触不同浓度(0、12.5、25、50μm)岩藻黄质48 h后,细胞周期分布的变化。6. AnnexinV-FITC法检测A549和H1299细胞这两种p53基因表型不同的NSCLC细胞接触不同浓度(0、12.5、25、50μM)岩藻黄质48h后,对细胞凋亡率的影响。7.实时定量PCR技术检测A549和H1299细胞接触不同浓度(0、12.5、25、50μM)岩藻黄质48 h后,P53、PUMA、Fas、p21WAF/CIP1、Bcl-2基因mRNA表达的变化。8.免疫印迹法检测A549和H1299细胞接触不同浓度(0、12.5、25、50μM)岩藻黄质48h后,P53、p-P53(ser15)、PUMA、Fas、p21WAF/cip1、Bcl-2蛋白表达的变化。9.比色法检测A549和H1299细胞接触不同浓度(0、12.5、25、50μM)岩藻黄质48h后, Caspase-3和Caspase-8的活性。10.岩藻黄质(538、768、1098、1568、240、3200 mg/kg)单次灌胃给予小鼠,给药后连续观察14天,观察动物的死亡及毒性情况。11.对数生长期的A549细胞以1×107／ml(0.2 ml／只)接种BABL/c裸小鼠躯干后1／3皮下,随机分成五组：岩藻黄质50 mg/kg组(8只),岩藻黄质15 mg/kg组(8只),岩藻黄质5 mg/kg组(8只),顺铂(DDP)1mg/kg组(8只)和溶剂(空白大豆油溶液)对照组(8只)。接种五天后岩藻黄质给药组灌胃给予岩藻黄质,溶剂对照组灌胃给予空白大豆油,每天一次连续5周。顺铂组腹腔注射DDP,每天一次,连续10天。每周三次测量肿瘤大小,计算体积。处死动物后称取瘤重,计算抑瘤率。12.病理切片HE染色观察移植瘤组织的病理变化。13.免疫组化染色观察岩藻黄质对移植瘤组织中P53、Bc1-2和Caspase-3蛋白表达的影响。14. TUNEL法检测岩藻黄质对移植瘤组织凋亡程度的影响。三、结果1.岩藻黄质对7种肿瘤细胞的生长均有不同程度的抑制作用,具浓度依赖性。与对照组比较,差异均具显著统计学意义。但对正常细胞,岩藻黄质仅在高浓度下具一定的抑制作用。实体瘤细胞对岩藻黄质的敏感性弱于血液系统肿瘤细胞。岩藻黄质处理K562、U937、Jurkat细胞24 h、48 h和72 h后可显著抑制这三种血液系统恶性肿瘤细胞的存活,其抑制作用具时间和浓度依赖性。2.岩藻黄质不同浓度(6.25、12.5、25、50μm)处理K562、U937、Jurkat细胞48 h后G0／G1期细胞数目明显增加,呈现G0/G1期阻滞。其中K562细胞由对照组的34.4±4.34%分别增加到38.0±1.41%、39.4±1.79%、41.43.79%和50.5±7.86%。U937细胞中由对照组的30.2±7.39%分别增加到39.6±4.14%、42.4±0.76%、47.2±3.00%和49.8±6.14%。Jurkat细胞中由对照组的43.4±5.34%分别增加到51.3±4.53%、52.3±5.1%、56.1±3.5%和58.4±4.49%。3.岩藻黄质不同浓度(6.25、12.5、25μM)处理K562、U937、Jurkat细胞48 h后诱导细胞凋亡。K562细胞中,凋亡率从对照组的4.73±2.60%增加到18.6±10.3%、24.0±12.3%和30.8±9.59%。(Fuco-25μM组与对照组比较,P<0.05)；U937细胞中,凋亡率从对照组的4.13±1.36%增加到14.3±0.6%、25.0±13.6%和65.3±12.3%(岩藻黄质各浓度组与对照组比较,P<0.01); Jurkat细胞中,凋亡率从对照组的2.43±0.21%增加到13.1±4.35%、28.7±15.2%和88.4±0.69%(岩藻黄质各浓度组与对照组比较,P<0.05或P<0.01)。4.岩藻黄质对四种NSCLC细胞生长均有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性和时间依赖性特征。四种NSCLC细胞对岩藻黄质的敏感性存在差异。野生型p53的NSCLC细胞(包括A549、H460和SPC-A1)对岩藻黄质的作用比p53缺失型的H1299细胞更为敏感,细胞存活率低于H1299细胞。5.岩藻黄质(12.5μM、25μM、50μM)作用于A549和H1299细胞48 h后,可阻滞细胞周期于G0／G1期。在A549细胞中,G0／G1期由对照组的45.7±5.33%分别增加到Fuco-12.5μM组的61.0±4.46%(与对照组比较,P<0.05)、Fuco-25μM组的61.3±3.95%(与对照组比较,P<0.01)和Fuco-50μM组的66.3±4.55%(与对照组比较,P<0.01)。在H1299细胞中,G0／G1期由对照组的39.0±6.51%分别增加到Fuco-12.5μM组的51.3+4.85%、Fuco-25μM组的56.2±4.62%(与对照组比较,P<0.05)和Fuco-50μM组的57.3±6.42%(与对照组比较,P<0.05)。在H1299细胞中岩藻黄质诱导G0／G1期阻滞的作用弱于A549细胞,但此差异无统计学意义(P>0.05)。6.岩藻黄质(12.5μM、25μM、50μM)作用于A549和H1299细胞48 h后,可诱导细胞凋亡。12.5μM岩藻黄质的凋亡诱导率可分别达到26.4±2.96%和18.1±4.38%,25μM达到38.6±7.13%和23.8±6.51%,50μM达到40.6±9.72%和27.9±2.07%,与对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)7.12.5μm、25μm、50μm的岩藻黄质作用于A549细胞48 h后,随岩藻黄质浓度增加,p53、p21WIF/cip1、PUMA和FAS基因mRNA的表达增加,而Bc1-2基因mRNA的表达减少。12.5μM、25μM、50μm的岩藻黄质作用于H1299细胞48 h后,p53基因无表达,p21 WIF／cip1、PUMA和Fas基因mRNA的表达增加,而Bc1-2基因mRNA的表达减少。8.免疫印迹实验结果显示,在H1299细胞中无P53及p-P53表达,而在A549细胞中,岩藻黄质各浓度组细胞P53、磷酸化p53(ser15)蛋白水平均高于对照组,且随药物浓度增加,其表达依次增高。在A549细胞和H1299细胞中,岩藻黄质各浓度组Bc1-2蛋白表达均低于对照组,且随药物浓度增加,其表达依次降低。岩藻黄质各浓度组细胞p21 WAF1／cip1、PUMA和Fas蛋白水平均高于对照组,且随药物浓度增加,其表达依次增高。H1299细胞中这些蛋白表达水平变化程度弱于A549细胞。9. Caspase-3活性检测实验结果显示不同浓度(12.5、25、50μM)岩藻黄质处理A549和H1299细胞48 h后,Caspase-3和Caspase-8的活性明显增强。10.急性毒性实验结果显示,岩藻黄质在538-3200 mg/kg剂量范围内灌胃(i.g.)给予小鼠,未出现动物死亡和明显毒副反应,是安全的。11.岩藻黄质可剂量依赖性的减慢裸鼠移植瘤的体积增长速度,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。但岩藻黄质给药组移植瘤的生长速度比顺铂组快(P<0.05或P<0.01)。岩藻黄质可剂量依赖性降低裸鼠移植瘤重。岩藻黄质高剂量组抑瘤率可达到78.1%,中剂量组为69.9%,低剂量组为62.0%,但均低于顺铂组的84.6%。实验结束后岩藻黄质给药组及溶剂对照组裸鼠体重与给药前比较明显增加。但顺铂给药组体重与给药前比较未明显增加。肝脾肾组织大小形态均未发现明显异常。表明裸鼠对岩藻黄质多次给药能良好耐受。12.HE染色后,光学显微镜下观察发现溶剂对照组A549细胞丰富密集,坏死很少。而岩藻黄质各剂量组及顺铂给药组A549细胞数目较溶剂对照组减少,坏死增多,并可见到细胞收缩、体积变小、核固缩蓝色深染的凋亡形态学改变。13.免疫组化实验结果显示,岩藻黄质各剂量组和顺铂给药组能降低移植瘤组织中P53和Bcl-2蛋白的表达,提高Caspase-3蛋白的表达。14. TUNEL实验结果显示岩藻黄质可诱导A549裸鼠移植瘤组织出现肿瘤细胞凋亡。各组凋亡率分别为：溶剂对照组为5.40±2.90%,岩藻黄质高剂量组50.2±14.4%,中剂量组35.5±10.7%,低剂量组22.9±3.97%,顺铂组58.6±11.9%。四、结论1.岩藻黄质可浓度依赖性抑制7种恶性肿瘤细胞的生长。2.岩藻黄质可诱导三种血液系统肿瘤细胞(K562、Jurkat、U937细胞)出现G0／G1期阻滞和凋亡。3.岩藻黄质可抑制不同p53基因表型NSCLC细胞的生长,这一作用呈浓度依赖性和时间依赖性。4.岩藻黄质可诱导A549细胞和H1299细胞出现G0／G1期阻滞和凋亡,这一作用呈浓度依赖性。且岩藻黄质对A549细胞的诱导作用强于H1299细胞。5.岩藻黄质在A549细胞中可上调p53及其靶基因p21 WAF1／CIP1、PUMA和Fas的mRNA及蛋白表达,上调磷酸化p53的蛋白表达。抑制Bc1-2的mRNA及蛋白表达。说明p53依赖性信号转导通路在岩藻黄质对A549细胞的周期阻滞和凋亡诱导作用中发挥重要作用。6.在H1299细胞中,岩藻黄质亦可上调p21 WAF1/CIP1、PUMA和Fas的mRNA及蛋白表达,抑制Bc1-2的mRNA及蛋白表达。说明在H1299细胞中,岩藻黄质亦可能经由p53非依赖性信号转导通路发挥细胞周期阻滞和凋亡诱导作用。7.岩藻黄质在568-3200mg/kg剂量范围内单次灌胃给药,小鼠未产生明显毒性反应。8.岩藻黄质在5-50mg/kg剂量范围内连续给药五周,能显著抑制人肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤的生长,且动物耐受性良好。9.岩藻黄质可诱导裸鼠A549移植瘤组织凋亡,降低P53和Bcl-2蛋白表达,增高Caspase-3蛋白表达。说明岩藻黄质发挥对A549移植瘤生长的抑制作用机制可能与p53、Bcl-2和Caspase-3参与的肿瘤细胞凋亡通路有关。