卵巢是雌性生物的重要生殖器官,其功能是产生卵子和分泌类固醇激素。卵巢分泌的激素影响雌性动物各种生理活动,包括性周期、生殖细胞的成熟、情绪的波动、骨骼的正常维持等等。卵泡在卵巢内的发育经历了一个招募、选择、激活、发育的过程。具体表现为：临近青春期,始基卵泡(primordial follicle)在各种因子的作用下被激活,卵泡开始发育,表现为卵泡体积增加,颗粒细胞层由单层向多层发展。当卵泡发育到窦前卵泡(pre-antral follicle)时,卵泡能感受促性腺激素(FSH、LH)的刺激。FSH以及E2的反馈机制使优势卵泡得以迅速成熟。卵泡在发育过程中逐渐向卵巢表面移行,成熟时呈泡状突出于卵巢表面。当卵泡发育成熟时,在促黄体激素LH的作用下,卵泡破裂,卵子以卵丘细胞-卵子复合体的形式被释放到输卵管中,等待受精。卵泡内的颗粒细胞在LH的作用下,跳出细胞周期,在LH刺激排卵后大约48小时,小鼠的卵泡细胞分化为成熟的黄体颗粒细胞,此时黄体形成。黄体分泌孕激素,孕激素在雌性生理和生殖过程中发挥着重要的作用。如果黄体功能异常则会导致流产或者不孕。在卵泡的激活,以及卵泡的成熟过程中,G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor, GPCR)发挥着重要功能。尤其是富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体(LGR)更是发挥着不可替代的作用。根据保守性分析,LGR有三大类型,第一类包括FSHR、 LHR、TSHR;第二类包括LGR4/5/6;第三类包括LGR7/8。其中第一类和第三类已有很多文献报道它们在生殖中发挥着重要的作用。由于结构上的相似性,我们相信,对孤儿受体Lgr4在生殖系统中的研究是非常有意义的。在Lgr4自1998年首次被克隆出来后,其许多生物学功能陆续被报道出来。动物模型实验显示缺失Lgr4基因会导致在许多方面的发育缺陷,包括胚胎子宫内生长阻滞以及胚胎期和出生后致死,骨的形成及重建功能异常,雄性生殖道发育缺陷,眼前节发育不良以及肾脏、毛囊、胆囊、胆囊导管等多个器官发育缺陷。最近还发现Lgr4基因帮助小肠中的潘氏细胞(Paneth Cell)分化以及对维持小肠干细胞干性发挥着重要作用。但迄今为止还很少有Lgr4在雌性生殖系统,特别是在卵巢中的功能和机制的相关研究报告。本实验利用Lgr4基因敲除小鼠模型,对Lgr4基因在雌性生殖系统包括卵巢和输卵管两方面进行了一系列功能和机制的研究。共分为以下三个部分：1 Lgr4在雌性生殖系统中的表达利用本实验室已经建立的Lgr4基因trap小鼠(PNAS 2008)进行LacZ染色。该品系的小鼠是在Lgr4的第一个内含子中插入了beta-gal报告基因。由于该报告基因的表达受到Lgr4启动子和增强子的调控,因此报告基因的表达能真实反应体内Lgr4的表达状况。通过lacZ染色,发现在卵巢中,Lgr4在黄体颗粒细胞中表达,且表达量随着黄体的成熟不断上升,又随着黄体的消退逐渐下降。在生殖道中, Lgr4在输卵管的上皮细胞中表达,且表达量亦随着动情周期的波动而波动,在子宫的肌肉层中,我们也检测到少量的Lgr4表达。2 Lgr4在卵巢中的功能研究实验室前期的数据显示,Lgr4敲除雌鼠不能正常怀孕,由此我们对Lgr4在生殖系统中的作用进行研究,因为卵巢是雌性生殖系统中最重要的生殖器官,又因为检测到Lgr4在卵巢的黄体颗粒细胞中表达,所以首先对Lgr4在卵巢中功能进行研究。实验显示Lgr4缺失会造成卵巢分泌孕酮的水平低下,并且这种激素水平的变化还影响到了小鼠的动情周期。对敲除小鼠和正常小鼠进行卵巢抑制手术后再检测小鼠血清中的孕激素水平,发现实验组和对照组的差距仍旧存在,这预示着Lgr4敲除使卵巢自身发育受到了影响。对Lgr4在生殖道上皮的研究,通过免疫组化和电镜实验,发现Lgr4敲除鼠输卵管壶腹部中的纤毛细胞和分泌细胞都明显减少了,电镜观察发现Lgr4敲除小鼠壶腹部的分泌细胞与对照野生型小鼠相比,形态也显得较不完整,暗示Lgr4在生殖道上皮中也可能有重要生理功能,但由于实验条件和方法的限制,具体功能和机制目前还不十分清楚。3 Lgr4在卵巢中的分子机制研究通过HE染色,发现Lgr4敲除鼠与野生型对照组相比,黄体颗粒细胞胞质含量少,在Lgr4功能检测中,我们发现敲除鼠的孕酮水平低下,所以我们对孕酮合成加工相关的关键基因进行了免疫组化,免疫印迹,以及realtime的检测,发现无论是体内还是体外,Lgr4敲除后,黄体颗粒细胞中的Stdr,Cyplla1等与激素合成相关基因都有了明显的下调,不仅如此,本实验还检测了与黄体形成,维持相关的其他重要标志基因,如Bhmt、Lht、Ptgfr等等,发现这些基因在Lgr4缺失后也都有了明显的下调。在机制上我们发现Egfr/Erk信号通路在Lgr4敲除的黄体颗粒细胞中被明显抑制。此外我们还构建了在黄体颗粒细胞中特异性敲除Erkl/2的小鼠,也发现了类似的表型,即Erk信号通路在黄体颗粒细胞中受阻黄体不能正常形成。有意思的是,当在培养体系中添加HB-EGF后,发现Lgr4缺失的颗粒细胞经体外黄化后,合成激素的功能有了回复,我们用免疫荧光的方法检测了Star,Cypllal,发现这两个与激素合成相关的酶有了很大程度的回复。此外,我们还检测了其他与黄体功能相关的基因,Prlr、Ptgfr、Lhr,发现这些基因也都有了不同程度的回复。综上所述, 本实验发现在雌性生殖系统中,Lgr4在卵巢颗粒细胞和生殖道上皮、平滑肌中都有表达。Lgr4在卵巢中的表达是随着黄体的发生而增加,又随着黄体的消退而下降的。当Lgr4缺失,卵巢中的黄体颗粒细胞异常,不能形成功能黄体,导致小鼠合成孕酮的水平下降,而Lgr4对孕激素合成的调节可能是通过激活Egfr/Erk这条信号通路来实现的。我的这一研究结果首次以在体的方式证明了Egfr/Erk信号通路在黄体形成中的作用,并且发现Lgr4在黄体颗粒细胞中能开启该重要信号通路。本研究为因黄体功能缺陷导致的不孕提供了可能的新的理论基础。