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第一部分let-7c的表达水平在胆管癌病人的肿瘤组织和血清中存在差异性目的:探索在胆管癌及对应正常胆管组织中差异表达的miRNA,并通过扩大组织样本量及对血清中miRNA的表达水平进行检测,从而选取下一步研究的实验对象。方法:我们在之前的研究中采用微阵列及表达谱芯片分析3对胆管癌及对应正常胆管组织得到差异表达的miRNA,通过扩大组织样本量进行实时定量PCR检测,对let-7c在胆管癌及对应正常胆管组织中的表达水平进行验证,同时检测其在血清中的表达情况。结果:1.扩大样本量验证结果显示let-7c在13对胆管癌及配对的癌旁组织中表达存在显著差异性,其在胆管癌组织中呈显著低表达。差异具有统计学意义。(P=0.034).2.Let-7c在无远处转移病人的血清中的表达低于有远处转移病人血清中的表达,且差异具有统计学意义(P=0.043)。结论:胆管癌组织中let-7c表达水平明显较低,在有远处转移及没有远处转移病人的血清中,let-7c表达存在差异性,且在有远处转移胆管癌病人血清中表达较高,差异均具有统计学意义。第二部分Let-7c对胆管癌细胞自我更新及肿瘤形成潜能的影响的研究目的:研究let-7c对胆管癌细胞自我更新能力及肿瘤形成潜能的影响方法:1、利用上调和下调let-7c表达的慢病毒载体转染人胆管癌细胞TFK-1,构建稳定转录的细胞株,经皮下分别注入BalB/c裸鼠右侧腋下,构建裸鼠皮下成瘤模型,检测其对胆管癌细胞成瘤潜能的影响。2、将之前提到的上下调表达let-7c的稳转细胞在体外利用克隆球形成实验对TFK-1细胞进行检测,并通过分化实验检测克隆球中内源性let-7c的表达情况。结果:1.过表达let-7c的TFK-1细胞显示其克隆球形成能力受抑制,let-7c表达下调的TFK-1细胞呈现出更强的克隆球形成能力及更高的自我更新能力。2.与对照组相比,下调let-7c表达会增强TFK-1细胞的成瘤能力,形成较大的肿瘤灶,过表达let-7c则能抑制TFK-1细胞的成瘤能力,使形成的肿瘤灶较小。且差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:Let-7c会影响胆管癌细胞TFK-1的克隆球形成及皮下成瘤能力。第三部分Let-7c在体内外对胆管癌侵袭转移的影响研究目的:研究let-7c在体内外对胆管癌侵袭及远处转移的影响方法:1、利用let-7c mimic/inhibitor转染胆管癌细胞TFK-1及EGI-1,构建瞬转细胞,通过transwell实验及划痕实验检测let-7c在体外对胆管癌细胞侵袭转移能力的影响。2、利用之前慢病毒转染得到的稳转细胞株构建裸鼠胆管癌远处转移模型,利用动物体外活体成像检测let-7c对胆管癌细胞远处转移能力的影响。结果:1、过表达let-7c明显抑制胆管癌细胞TFK-1及EGI-1在体外的侵袭转移能力,下调let-7c表达会促进TFK-1及EGI-1在体外的侵袭转移能力。与阴性对照相比,实验组结果具有统计学意义(P<0.01)。2、上调let-7c表达的胆管癌细胞TFK-1形成的远处转移灶多于对照组,相反的,下调let-7c表达的TFK-1细胞形成的远处转移灶少于对照组,所得实验结果具有统计学意义。结论:在体内和体外,let-7c对胆管癌细胞侵袭转移的调控起着不同的作用。第四部分Let-7c对胆管癌自我更新、肿瘤形成及侵袭转移能力影响的靶点及机制的研究目的:检验let-7c影响胆管癌细胞自我更新、肿瘤形成及侵袭转移能力的靶点及通路并指明let-7作用靶点的生物学功能。方法:1、通过targetscan预测let-7c在胆管癌中可能起作用的靶基因,利用western blot检测调控let-7c表达后预测靶基因在蛋白水平的表达变化。2、通过western blot及免疫组化实验检测预测靶基因在胆管癌组织及正常癌旁组织中的表达情况。3、利用双荧光素酶报告基因技术,检测let-7c与预测靶基因之间的关系。4、构建靶基因siRNA及shRNA,在胆管癌细胞中对靶基因进行功能学验证。结果:1、明确let-7c靶向作用于EZH2及DVL3,直接结合他们的3’非编码区,抑制其蛋白水平的表达,并通过DVL3间接调控beta-catenin在蛋白水平的表达。2、证实在胆管癌组织中EZH2及beta-catenin在蛋白水平的表达低于正常胆管组织中的表达。3、Let-7c通过抑制EZH2从而抑制胆管癌细胞的自我更新、成瘤潜能及体外侵袭转移的能力4、Let-7c通过抑制DVL3/beta-catenin通路影响胆管癌细胞在体内的远处转移。结论:1、Let-7c直接作用于EZH2及DVL3,并通过DVL3间接调控beta-catenin,从而发挥效应。2、Let-7c通过EZH2及DVL3/beta-catenin通路影响胆管癌的侵袭转移及干细胞样特性。