背景和目的人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)可促进神经系统疾病的功能恢复。但是,损伤部位的炎症微环境并不利于干细胞的存活,严重影响干细胞的疗效。因此,改善损伤部位炎性微环境可能是提高干细胞疗效的新策略。神经炎症是导致神经系统疾病发生和发展的主要原因。活化的小胶质细胞在早期可清除损伤或坏死的神经细胞促进神经修复,但是,持续激活的小胶质细胞可释放肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子诱导神经炎症加重神经损伤。研究表明,NLRP3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小体广泛存在于激活的小胶质细胞中,调控神经炎症。因此,以小胶质细胞活化和NLRP3炎性小体为突破口,寻找靶向调控神经炎症的治疗方式并探索其机制至关重要。MG53(Mitsugumin53)是TRIM家族蛋白成员,又称TRIM72,在细胞和组织损伤中发挥重要作用。研究表明MG53蛋白可增强hUC-MSCs的抗氧化能力,提高干细胞对创伤性脑损伤的修复效果。此外,MG53蛋白可抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻LPS对小鼠海马神经元细胞诱导的神经毒性。但是,在炎性微环境下,MG53蛋白对hUC-MSCs和神经损伤小鼠的保护作用和机制还有待进一步探索。本课题以MG53蛋白为切入点,通过体内外实验研究MG53蛋白对hUC-MSCs炎症损伤和脑组织损伤部位神经炎症的调控作用和分子机制。方法第一部分:MG53蛋白抑制NLRP3通路降低LPS对hUC-MSCs和C57/BL6小鼠诱导的炎性损伤(1)采用CCK-8实验检测LPS对hUC-MSCs活性的影响,流式细胞术、Western blot、q RT-PCR评价炎症因子的释放和细胞凋亡,建立LPS诱导的hUC-MSCs炎性损伤模型;后续实验分为四组:正常培养组(CON)、LPS处理组(LPS)、MG53蛋白处理组(MG53)和LPS+MG53蛋白处理组(LPS+MG53)。采用Ed U染色、流式细胞术、Transwell、氧化应激试剂盒检测MG53蛋白对LPS诱导hUC-MSCs的增殖、凋亡、周期、迁移能力以及氧化应激水平(线粒体膜电位、ROS、SOD、MDA、GSH-PX)的影响;Western blot检测凋亡蛋白(Bax和Bcl-2)、周期蛋白(Cyclin D1)的表达;炎症芯片和q RT-PCR检测多种炎症因子的表达;Caspase-1活性检测试剂盒检测Caspase-1酶活性;Western blot检测NLRP3炎症小体通路相关蛋白(NLRP3、Cleaved-caspase1和IL-1b)的表达。(2)3月龄的C57/BL6小鼠腹腔注射0.25mg/kg的LPS,连续7天,每天一次,建立LPS诱导的C57/BL6神经炎性损伤模型;将小鼠随机分为LPS组、LPS+MG53组、LPS+MSC组和LPS+MG53+MSC组;水迷宫、强迫游泳、新事物识别和糖水偏好实验评价小鼠学习认知功能;Di I染色检测干细胞迁移能力;免疫荧光检测βIII tubulin、Nestin、DCX评价小鼠脑组织神经再生;免疫荧光标记Iba1、i NOS、ARG1、CD86检测小胶质细胞活化;ELISA检测炎症因子的表达;Caspase-1活性检测试剂盒检测Caspase-1酶活性;Western blot检测NLRP3炎症小体相关蛋白的表达。第二部分MG53蛋白联合hUC-MSCs移植抑制NLRP3通路减轻TBI小鼠的神经炎症自由落体打击法建立小鼠TBI模型,随机分为Sham组、TBI组、MSC组、MG53组和MSC+MG53组;伊文思蓝染色,免疫荧光和Western blot检测Occludin、ZO-1、Claudin-5蛋白表达评价血脑屏障的通透性;HE染色、CD3和GFAP免疫荧光检测炎症浸润情况;ELISA、q RT-PCR检测炎症因子表达,免疫荧光检测i NOS、ARG1、CD86、CD206、Iba1表达评价小胶质细胞M1/M2的极化;免疫荧光和q RT-PCR检测βIII tubulin、Nestin、DCX、BDNF、NGF的表达;Western blot检测NLRP3炎症小体相关蛋白的表达。结果第一部分:MG53蛋白抑制NLRP3通路降低LPS对hUC-MSCs和C57/BL6小鼠诱导的炎性损伤1.200 mg/m L的LPS处理hUC-MSCs 48h可以诱导细胞凋亡并促进IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1、IL-1β的表达,建立hUC-MSCs炎性损伤模型。与LPS组相比,MG53蛋白处理可促进hUC-MSCs存活、降低LPS诱导的凋亡,提高hUC-MSCs的迁移能力(P<0.05);MG53蛋白可减少线粒体膜损伤,降低ROS、MDA表达,促进SOD、GSH-PX活性(P<0.05),进而降低LPS对hUC-MSCs诱导的氧化应激水平;MG53蛋白抑制LPS诱导的促炎因子(IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8及IL-13)表达,并促进抑炎因子(IL-4以及IL-10)的表达(P<0.05)。此外,MG53蛋白抑制NLRP3/caspase-1/IL-1β信号轴关键蛋白TLR4、NLRP3、Cleaved-caspase1、IL-1β的表达(P<0.05),进而改善LPS诱导的hUC-MSCs的炎症反应。2.LPS可诱导C57/BL6小鼠急性脑损伤,主要表现为学习记忆功能受损。与LPS组相比,水迷宫、新事物识别、强迫游泳、糖水偏好结果显示MG53蛋白移植、hUC-MSCs移植或MG53蛋白联合hUC-MSCs移植均可以改善LPS诱导小鼠的学习记忆功能障碍,且联合组较单独治疗组具有更好的神经保护作用(P<0.05);MG53蛋白促进hUC-MSCs在脑组织的迁移,增强βIII tubulin、Nestin、DCX的表达,促进神经再生(P<0.05);MG53蛋白联合hUC-MSCs移植降低M1型小胶质细胞标记物CD86、i NOS的表达,促进M2型标记物ARG1的表达(P<0.05),进而改善小胶质细胞M1/M2型的极化。机制研究显示MG53蛋白联合hUC-MSCs移植可调控炎症因子表达,抑制NLRP3炎性小体通路相关蛋白TLR4、NLRP3、Cleaved-caspase1、IL-1β蛋白的表达,进而抑制LPS对C57/BL6小鼠诱导的神经炎症,发挥神经保护作用。第二部分:MG53蛋白联合hUC-MSCs移植抑制NLRP3通路减轻TBI小鼠的神经炎症1.与TBI组相比,免疫荧光和Western blot检测结果显示MSC组、MG53组和MSC+MG53组小鼠均表现为伊文思蓝(EB)荧光强度降低、紧密连接相关蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5蛋白表达升高,且联合组较单一治疗组效果更佳(P<0.05),说明MG53蛋白联合hUC-MSCs移植可提高TBI小鼠血脑屏障的完整性;MG53蛋白联合hUC-MSCs移植减少炎性细胞的浸润和CD3、GFAP的表达(P<0.05),降低i NOS表达,促进ARG1的表达(P<0.05),改善损伤部位炎症微环境。此外,MG53蛋白联合hUC-MSCs移植抑制M1型小胶质细胞的活化,提高M2型小胶质细胞的活性(P<0.05),增强βIII tubulin和Nestin的表达(P<0.05),促进神经再生。2.机制研究显示,与TBI组相比,MG53蛋白联合hUC-MSCs移植能够降低TLR4、NLRP3、Cleaved-caspase1、IL-1β、TNF-a蛋白的表达,增强IL-10的表达(P<0.05),说明MG53蛋白联合hUC-MSCs移植可抑制NLRP3/caspase-1/IL-1β信号轴调控神经炎症。结论1.MG53蛋白可抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路减轻LPS对hUC-MSCs和C57/BL6诱导的炎症损伤,促进hUC-MSCs在体内外的存活和迁移,降低神经炎症水平,发挥神经保护作用;2.MG53蛋白联合hUC-MSCs移植可增强TBI小鼠血脑屏障的完整性,调控M1/M2型小胶质细胞的极化,促进神经再生,提高hUC-MSCs移植对TBI的神经修复作用,其机制与NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的抑制有关。