目的：　　[1]构建重组质粒pET21a(+)/ePD-L1（extracellular domain of PD-L1，ePD-L1），并制备ePD-L1蛋白(鼠源性)；　　[2] 用ePD-L1蛋白免疫兔制备抗PD-L1兔血清；　　[3] 分别预测人和小鼠的PD-L1的优势B表位，并进行匹配分析，以找到可能和功能相关，且不同种属间同源性较高的优势B细胞表位；　　[4] 利用PD-L1优势B表位合成肽对实验室已构建的噬菌体随机 affibody 文库进行淘洗；　　[5] 筛选与PD-L1优势B表位合成肽特异性结合的高亲和性的亲和体 affibody，标为 ZPD-L1；　　[6] 通过原核表达系统制备 ZPD-L1蛋白，并鉴定其与PD-L1蛋白的亲和性；　　[7] 建立PD-1/PD-L1结合体外模型，为验证ZPD-L1的阻断作用提供基础；　　方法：　　[1] 构建重组质粒 pET21a(+)/ePD-L1，并制备ePD-L1蛋白：　　将小鼠ePD-L1核酸序列经原核密码子优化后交给上海祥音生物科技有限公司全序列合成，并通过Ned Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点克隆至pET21a(+)质粒 ， 构 建pET21a(+)/ePD-L1重组质粒，转化到E.coli BL21 中，并测序鉴定 。经最适条件（温度、IPTG 浓度、时间）诱导表达的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，并用Western blot蛋白印迹鉴定，收集菌体，进行超声离心后取上清，用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行蛋白纯化，并进行SDS-PAGE电泳。　　[2] 用ePD-L1蛋白制备抗PD-L1兔血清：　　将 6-8周龄雌性日本大耳白兔分为2 组，即ePD-L1重组蛋白组和PBS对照组，每组3只。将纯化后的ePD-L1重组蛋白与佐剂等体积混匀后背部皮下多点免疫兔，共免疫三次（即 1、3、5 周）。0、2、4、6周耳缘静脉取血，并采用ELISA 法检测血清中ePD-L1特异性 IgG 水平。在血清滴度达到1：40000以上后，心脏取血。培养小鼠黑色素瘤 B16 细胞株，通过细胞免疫荧光和 Western blot 蛋白印迹验证其特异性。　　[3] 分别预测人和小鼠的PD-L1的优势B表位，并进行同源性分析：　　以人和小鼠的程序性死亡受体配体-1(PD-L1)的全长氨基酸序列为基础，利用生物信息学软件，采用 Hopp&Woods 的亲水性方案、Zimmerman 极性参数、Jameson-Wolf抗原指数方案和Emini表面可及性方案等，结合PD-L1的二级结构与其柔性区域对PD-L1的优势B细胞表位区段进行综合分析，建立3D模型，结合功能定位，进一步运用抗原指数分析预测，将人与小鼠的B细胞表位进行对比分析，并与多种实验动物进行同源性分析。将筛选的B细胞表位交给上海波泰生物科技有限公司合成。　　[4] 利用实验室已构建的噬菌体随机 affibody 文库对PD-L1优势B表位合成肽进行淘洗：　　以上述预测的优势B细胞表位合成肽为靶标，用噬菌体随机 affibody 文库进行两轮淘洗。　　[5] 筛选与PD-L1优势B表位合成肽特异性结合的高亲和性的亲和体 affibody，标为 ZPD-L1：　　随机挑取两轮淘洗后的 affibody 单克隆，用 ELISA、测序等方法选取affibody 分子，标为ZPD-L1。　　[6] 制备 ZPD-L1蛋白，并鉴定其与PD-L1蛋白的亲和性：　　将筛选得到的 affibody 阳性克隆ZPD-L1克隆入载体 pET21a(+)，构建成重组质粒 pET21a(+)/ZPD-L1，转化到E.coli BL21 中，并测序鉴定。表达、纯化ZPD-L1蛋白；培养小鼠黑色素瘤B16细胞株；培养小鼠结肠癌细胞CT26，种植肿瘤于BALB/C小鼠皮下，建立肿瘤组织模型。利用ELISA技术鉴定ZPD-L1蛋白与ePD-L1优势B细胞表位合成肽的亲和性，并用细胞免疫荧光和免疫组化鉴定ZPD-L1蛋白与PD-L1蛋白的亲和性和特异性。　　[7] 建立体外模型并验证：　　1）构建重组质粒 pGEX-4T-1/ePD-1，并制备ePD-1蛋白：　　将小鼠ePD-1核酸序列经原核密码子优化后全序列合成，并通过EcoRl和Xhol酶 切 位 点 克 隆 至pGEX-4T-1质 粒 ， 构 建 pGEX-4T-1/ePD-1重组质粒，转化到BL21 E.coli中，并测序鉴定。经最适条件（温度、IPTG浓度、时间）诱导表达的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，并用Western blot蛋白印迹鉴定，收集菌体，尿素重悬，进行超声离心后取上清，用复性缓冲液( 50 mmol/L Tris-HCl、1．0 mmol/L EDTA、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L DTT、0．2 mmol/L精氨酸，pH7．4)4℃复性24 h。再经过梯度透析到PBS（pH8．0）中，用GST亲和层析柱进行蛋白纯化，并进行SDS-PAGE电泳。　　2）建立体外模型：　　利用细胞免疫荧光和 ELISA 技术鉴定ePD-1蛋白与 PD-L1蛋白的亲和性和特异性。　　结果：　　[1] 通过测序图及 PCR 鉴定 pET21a(+)/ePD-L1 重组质粒构建成功。将pET21a(+)/ePD-L1重组质粒转入 E.coil BL21 菌株进行原核表达，在 37℃，IPTG 浓度为 1.0mM 下诱导 7h 表达 MAGE-A3 重组蛋白条件最佳。SDS-PAGE示目的蛋白分子质量大小约为 26KDa，与预期蛋白大小一致，并以 his 单抗进行Western Blot鉴定，出现了特异性的单一条带。进一步收集菌体，采用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行蛋白纯化，获到纯化蛋白，浓度为400μg/ml。　　[2] 日本大耳白兔经 ePD-L1 重组蛋白免疫后，可产生高效价的血清特异性ePD-L1 IgG抗体，且随免疫次数的增加抗体效价相应增加。以ePD-L1重组蛋白作为靶蛋白，兔血清作为一抗，做Western blot蛋白印迹验证，出现了特异性的单一条带。细胞免疫荧光结果显示在B16细胞膜上出现绿色的荧光团块，与细胞内的PD-L1分布位置相一致。　　[3] 人和小鼠PD-L1均为一型跨膜蛋白，均由290个氨基酸残基组成，相对分子质量均为33 kDa。人和小鼠PD-L1的胞外段分别位于N端的19~238和19~239。经综合分析，与PD-1，PD-L1结合相关的人和小鼠的B细胞优势表位可能分别位于其氨基酸序列N端的41～46，60~63，71~75和40~48，58~63，72~88区段，即KFPVEK，EDKN，EEDLK和RFPVERELDL，EKEDE ，EDLKPQH肽段；同源性分析显示包含本研究所预测的表位的氨基酸序列在多种动物之间高度保守。多肽PVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQH（小鼠PD-L1中一段连续氨基酸序列，包含上述三段优势B表位）由公司成功合成。　　[4] 通过两轮淘洗后，经 ELISA 检测和测序，最后选取八个高亲和力的克隆进行后续实验。　　[5] 构建了pET21a(+)/ZPD-L1重组质粒，表达和纯化蛋白，经 SDS-PAGE 电泳证实在约为 7kDa 的位置出现目的条带，其分子质量大小与预期相符；最后选取三个高表达，不会形成二聚体的克隆进行后续实验。　　[6] ZPD-L1的细胞免疫荧光结果显示在B16细胞膜上出现绿色的荧光团块，与细胞内的PD-L1分布位置相一致。于BALB/C小鼠皮下成功接种CT26肿瘤，成功建立肿瘤组织模型。ELISA的结果显示其与PD-L1优势B表位合成肽能特异性结合。免疫组化结果显示ZPD-L1实验组为阳性，且与阳性对照的结果一致。　　[7] 通过测序图鉴定pGEX-4T-1/ePD-1 重组质粒构建成功。将pGEX-4T-1/ePD-1重组质粒转入E.coil BL21菌株进行原核表达。SDS-PAGE示目的蛋白分子质量大小约为42KDa，与预期蛋白大小一致，并以GST单抗进行Western Blot鉴定，出现了特异性的单一条带。进一步收集菌体，采用GST Agarose亲和层析柱进行蛋白纯化，获到纯化蛋白，浓度为 400μg/ml。　　[8] ePD-1蛋白的细胞免疫荧光结果显示在B16细胞膜上出现绿色的荧光团块，与细胞内的PD-L1分布位置相一致。ELISA的结果显示其与ePD-L1重组蛋白能特异性结合。　　结论：　　[1] 验证了本实验室构建的噬菌体随机 affibody 文库可用于靶蛋白的淘洗。　　[2] 成功制备了PD-L1特异性兔多克隆抗体。　　[3] 成功筛选出三个与PD-L1蛋白有亲和力的 affibody分子。　　[4] 验证了ePD-1重组蛋白与PD-L1蛋白有亲和力，成功建立了体外模型。