论文部分内容阅读
miR169家族是植物中最大和最保守的miRNA家族,研究已经确定miR169/NF-YA模块是植物发育和应激反应的重要调节因子,miR169在马铃薯中的功能仍然不明确。本文首先运用多序列比对、构建系统进化树等生物信息学手段对马铃薯miR169家族和预测NF-YA靶基因进行初步功能分析,然后构建小串联模拟靶标STTM169和PBI121-StmiR169过表达载体进行遗传转化,经荧光定量PCR对再生植株进行检测;最后胁迫处理转基因材料进行转录组测序分析,研究马铃薯miR169a的功能及其调控网络。本论文主要研究结果如下:1、从miRBase 22.1版数据库里下载马铃薯miR169家族所有前体和成熟体序列,运用DNAMAN 6.0软件对前体序列进行二级结构预测和比对,具有56.15%的一致性;用PlantCare对启动子上游区域1500 bp序列进行顺式作用元件分析,StmiR169家族基因启动子元件主要有:脱落酸诱导元件ABRE,光响应Box 4、Gap-box等元件,激素调控元件TGA-element、GARE-motif等和DRE、MYB、MYC等胁迫调控元件。StmiR169靶基因生物信息学预测得到6个核转录因子Y A亚基编码基因,对靶基因进行Motif分析、功能域预测和三级结构建模,结果显示6个靶标均有CBFB/NF-YA和DNA结合亚域;系统进化树表明LOC102589526、LOC102578385、LOC102595987、LOC102595015、LOC102587642和LOC102599915基因编码的氨基酸序列分别与拟南芥的NF-YA1/9、大豆的NF-YA3、番茄的NF-YA1、番茄的NF-YA3、拟南芥的NFYA2/10和番茄的NF-YA2氨基酸序列同源性最高。2、以鄂薯3号(E3)微型薯为转化材料,构建小串联模拟靶标(Short Tandem Target Mimic,STTM)和过表达(PBI121)载体进行遗传转化来研究马铃薯StmiR169a的功能,获得miR169小串联模拟靶标和过表达再生植株分别有7和27株。经PCR和荧光定量PCR验证,获得6株马铃薯STTM 169的阳性植株(S169)和5株过表达阳性植株(OE169)进行后续研究。3、组织特异性表达研究发现,基因StmiR169a的表达量从高至低依次是茎、根、匍匐茎、块茎和叶;靶基因LOC102589526在根中的表达量最高,靶基因LOC102587642在块茎中表达量最高。在正常条件下,E3的野生型与转基因植株无明显表型差异;用JEM-1200EX型电镜扫描分析,发现S169材料叶表皮细胞增大,气孔密度降低;OE169材料叶表皮细胞减小,气孔密度增大。光合作用分析发现S169-2/4/5材料的净光合速率均显著低于E3野生型,而所有S169植株的SPAD值也低于E3野生型。荧光显微镜观察发现S169的根毛密集程度、长度和形状上和E3有明显差异。在NaCl和KCl盐胁迫处理下,S169(-4)的株高较E3明显矮化。4、利用RNA-Seq技术比较小串联模拟靶标STTM 169转基因植株(S169)的转录组和E3,以马铃薯(PGSC＿DM＿v4.03)为参考基因组。结果表明:与对照比较,S169(-4)盐胁迫下有640个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)。盐胁迫下GO富集和KEGG代谢途径富集分析发现,DEGs主要与苯丙烷类生物合成通路、光合作用-天线蛋白、光合作用中的碳固定代谢通路、植物激素信号转导通路和玉米素生物合成等通路相关。研究发现,盐胁迫下DEGs涉及到的光合作用、气孔发育和生长素信号转导途径都有StmiR169a的靶标NF-Ys(也称为CBF或HAP)家族基因的参与。转录组结果分析显示靶标基因NF-YAs(LOC102578385、LOC102595987和LOC102587642)可能与FAMA基因调控气孔的分裂。