本研究对JFH1 NS5A蛋白在病毒复制和感染中的作用进行了研究。首先建立J6JFH1 (HCV 2a J6的core-NS2与JFH1 NS2-3UTR组成的2a/2a嵌合体)的体外细胞模型,并在原核和真核细胞中表达NS5A蛋白；通过基因置换的方法构建全长基因型间的嵌合基因组,通过比较嵌合体与野生型基因组的复制效率和产生细胞培养产生的HCV(cell culture produced HCV,HCVcc)的能力,探讨了NS5A在JFH1株体外高效复制和感染中发挥的作用。此外,本研究还对多种微生物16S rDNAs的序列比对与进化树进行分析,设计、合成了微生物通用及特异性引物,初步建立了基于16S rDNAs的快速筛检血液及血液制品中微生物污染的荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)方法。 一、HCV 2a FL-J6JFH细胞感染模型的建立 全长HCV 2a型基因组FL-J6JFH和复制缺陷型阴性对照FL-J6JFH(GND)线性化后体外转录成RNA,脂质体介导转染Huh-7.5细胞。抽提细胞总RNA,逆转录成cDNA后作为模板,以HCV特异的荧光定量PCR(FQ RT-PCR)检测转染细胞内HCV RNA水平。转染后第5天,FL-J6JFH转染细胞内HCV RNA为1.2×106GE/μg RNA,在第9天,下降到最低水平6.9×105GE/μg RNA：在13天,上升到最高值6.5×106GE/μg RNA。此后直至第59天,细胞内RNA水平保持在106 GE/μg RNA。与之相对,阴性对照FL-J6JFH(GND)转染细胞后HCVRNA很快消失。以丙型肝炎患者血清为抗体,免疫荧光染色观察转染细胞内HCV蛋白表达。结果显示第5天至第59天,FL-J6JFH转染的细胞内可以检测到HCV蛋白表达,而FL-J6JFH(GND)转染和FL-J6JFH转染以正常人血清检测的细胞内都未观察到HCV蛋白阳性细胞。上述结果表明,转染的FL-J6JFH可以在Huh-7.5细胞内长时间有效复制。收集转染细胞上清感染naive Huh-7.5细胞,3天后免疫荧光法检测HCV蛋白阳性细胞。从第5天开始收集的各个时间点的FL-J6JFH转染细胞的上清,感染细胞后都可见HCV蛋白表达。由此可见,全长2a型基因组FL-J6JFH转染细胞后,能够产生具有感染性的病毒颗粒(HCVcc)。该细胞感染模型的建立为研究HCV各基因结构在病毒复制和HCVcc包装成熟中的作用提供了实验平台。 二、JFH1 NS5A蛋白的表达与鉴定 PCR特异扩增JFH1 NS5A基因,克隆入pET-32a和pEGFP-N1载体,构建JFH1 NS5A的原核和真核重组表达质粒pET-JFH1 NS5A和pEGFP-JFH1 NS5A。将pET-JFH1 NS5A转化大肠杆菌BL21(DE3),pEGFP-JFH1 NS5A转染HEK 293T细胞,在原核与真核系统中进行表达,以SDS-PAGE、荧光显微术和Western blotting方法检测目的蛋白的表达。SDS-PAGE电泳检测到融合蛋白在原核细胞中的表达,荧光显微镜观察、Western blotting检测证实了EGFP-JFH1 NS5A融合蛋白在HEK 293T细胞中表达。利用PubMed BLAST软件对JFH1与HCV1a、1b、2b和2c型NS5A蛋白间的同源性进行分析。BLAST分析显示,JFH1和H77、HC-J4、HCV-J8和BEBE1病毒株NS5A蛋白的同源性分别为57％、60％、68％和74％。JFH1 NS5A蛋白在原核与真核细胞中表达成功,为研究HCV NS5A在JFH1株复制中的作用、NS5A与病毒其它蛋白以及宿主蛋白间的相互作用提供了材料。 三、JFH1 NS5A基因置换对FL-J6JFH病毒复制和感染性的影响 采用重叠延伸PCR方法联合酶切反应,用我国HCV感染最常见的基因型(1b型HC-J4株)的NS5A替换了FL-J6JFH的相应基因,构建基因型间嵌合体FL-J6JFH/J4NS5A。将其和野生型FL-J6JFH体外转录后分别转染Huh-7.5细胞。FQ RT-PCR比较二者转染细胞在培养过程中HCV RNA水平差异。结果显示,嵌合体的复制动力学较野生型明显减缓。在第9天后的任一时间点,嵌合体转染细胞内HCV RNA水平都显著低于野生型转染细胞(p<0.05)。在第34天,嵌合体转染细胞内HCV RNA水平最高,达5.6±1.8×104 GE/μg RNA,比野生型转染细胞的最高值低126倍(第13天,p<0.05)。用免疫荧光染色和Western blotting检测转染细胞内HCV蛋白表达情况：在第9天后的各个时间点,嵌合体和野生型FL-J6JFH转染组在荧光显微镜下都观察到了HCV蛋白阳性细胞。在第9天,裂解野生型转染细胞Western blotting检测到了NS5A蛋白,而嵌合体转染细胞未检测到。在第13天和59天,嵌合体转染细胞内也可以检测到NS5A蛋白,但表达量明显少于野生型转染细胞。收集细胞上清,梯度稀释后感染naive Huh-7.5细胞,测定转染细胞上清的感染滴度。发现嵌合体转染细胞上清HCVcc滴度显著低于相同时间点的野生型细胞上清(p<0.05),上清感染性滴度最高为78.3±23.6 ffu/ml,低于野生型上清最高值300倍(p<0.05)。此外,还观察到了嵌合体和野生型FL-J6JFH转染细胞后所致细胞病变效应,自第13天开始,野生型FL-J6JFH转染细胞培养物中持续出现大量不贴壁的细胞,细胞生长缓慢并大量死亡。13天以后,野生型转染细胞内病毒RNA和释放到上清中的HCVcc量均达到最大值并维持较高水平。与之相对,嵌合体转染细胞一直未观察到细胞病变效应。 四、JFH1 NS5A基因对HC-J4株病毒复制和感染性的影响 将JFH1 NS5A置换至HC-J4基因组内,构建嵌合全长基因组HC-J4/JFHNS5A。将嵌合体和野生型HC-J4的RNA转录体分别转染Huh-7.5细胞,用免疫荧光染色和HCV负链RNA特异性RT-PCR法检测二者在转染细胞内的蛋白表达和基因复制情况。免疫荧光染色未观察到HCV蛋白在转染了嵌合体和野生型HC-J4细胞内的表达,但在转染18天以内的各个时间点,转染细胞内都检测到了HCV负链RNA。表明嵌合体和野生型HC-J4在转染细胞内呈低水平复制。FQ RT-PCR比较转染细胞中HCV RNA水平。转染后第9天和第12天,嵌合体转染细胞内HCV RNA水平高于野生型转染的细胞(p<0.05)。但与阳性对照FL-J6JFH相比,一段时间后转染细胞内的HCV即被宿主细胞清除。 五、基于16S rDNAs的血液微生物污染快速检测研究 对20余种常见致病细菌的16S rDNAs进行多序列比对,设计扩增细菌16S rDNAs的FQ-PCR通用引物。以12种常见致病细菌、2种真菌、1种支原体、1种病毒和人基因组DNA为模板,验证通用引物检测细菌的特异性。以通用引物扩增金黄色葡萄球菌16S rDNA靶片段,构建标准质粒pMDT-Bfr,并建立FQ-PCR定量标准曲线。分别以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作为革兰阳性和革兰阴性细菌代表菌,以其不同浓度的DNA为模板进行FQ-PCR反应,检验该方法的敏感性。抽提梯度稀释的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌模拟血液细菌污染标本的总DNA作为FQ-PCR反应模板,检验基于16S rDNAs的FQ-PCR作为血液细菌污染检测方法的敏感性。 小结： 1.建立了HCV 2a型FL-J6JFH的Huh-7.5细胞感染模型,能够高效自主复制并产生感染性病毒颗粒(HCVcc),为进行HCV各基因结构功能的研究提供了实验平台。 2.用HCV 1b型HC-J4株的NS5A置换FL-J6JFH的相应基因,构建了基因型间嵌合体FL-J6JFH/J4NS5A。与野生型相比,嵌合体在体外复制效率明显降低,HCVcc产量显著减少。将JFH1 NS5A置换至HC-J4基因组内,在一定程度上提高了HC-J4 RNA的体外复制水平。表明NS5A在JFH1株高效复制中发挥着关键作用。 3.基因型间嵌合体FL-J6JFH/J4NS5A产生的病毒产物和感染性颗粒远低于野生型FL-J6JFH,但不产生细胞病变作用,可能更接近天然存在的HCV,可用作比较研究NS5A功能、评价以NS5A为药靶的抗病毒药物疗效的有力工具。 4.初步建立了以16S rDNAs作为FQ-PCR靶基因快速检测血液细菌污染的方法。该方法特异性强、灵敏度高、成本低廉,具有潜在应用前景。